Αξιοποίηση βιονεργών ενώσεων στην παραγωγή σκευασμάτων διατροφής με λειτουργικές ιδιότητες: η περίπτωση των φύλλων της Olea europaea L.

Abstract

The present work is a project on the establishment of olive leaf as a natural source of bioactive ingredients, suitable for commercialization all over the year. Examination of the impact of sampling parameters such as cultivar, leaf age and sampling date on the radical scavenging potential of extracts prepared from a great number of systematically collected samples, was based on the determination of total and individual phenolics, as well as on the antioxidant activity assessment using complementary techniques and methods. Olive leaf was chosen as a cheap and annually available antioxidant source as a) currently a whole range of olive leaf based products are advertised on the international market due to its bioactive composition and b) no matter the standardization requirements such products encounter, knowledge of the effect of factors that may notably affect the composition and antioxidant potential of the raw material collected from the tree to be further utilized in multifunctional preparations is not available. Variability due to “cultivar” effect was examined for mature leaves of ten Greek cultivars, an Italian and a Spanish one, grown under the same environment, whereas “within cultivar” effect was also examined for two representative Greek cultivars. In order to investigate the possibility to exploit all types of leaves expected in the shoots of an olive branch new, mature, old and yellow leaves of the same tree and same sampling date were studied. Repetition of sampling for the case of “cultivar” and “leaf age” effect study was carried out for findings clarification. Moreover, “sampling date” effect was examined for new leaves of the two representative Greek cultivars over a six-month sampling period. Leaf polar extracts, presented qualitatively similar HPLC phenolic profiles, irrespectively of cultivar, age and/or sampling date. Monitoring showed remarkable differences in the content of certain phenolics. Despite the alleged view, neither oleuropein, nor other secoiridoid compounds were always the major ingredients. In certain cases, other constituents shared with them total peak area recorded. In general, main leaf phenolics were found to be hydroxytyrosol, verbascoside, luteolin 7-O-glucoside, luteolin 4’-O-glucoside, oleuropein and luteolin. Total flavonoids seem to hold a considerable percent of the total leaf phenolics, irrespectively of sampling parameters. Considerable differences noted in individual phenol levels among samples were not reflected either to the total phenol content or flavonoid content or total radical scavenging potential of the extracts. Olive leaf was found a robust source of radical scavengers throughout the year and differentiation in the levels of individual components was rather attributed on the phenological stage of the leaf during sampling than on cultivar or age. The radical scavenging activity of leaf polar extracts was verified apart from the DPPH˙ assay, through ABTS˙⁺, CBA and ORAC assays based on different principles. The robust overall antioxidant potential of olive leaf extracts, regardless the significant quantitative variabilities observed from sample to sample, was attributed to the significant contribution of the individual constituents. Indeed, the extent to which individual phenolics contribute to the overall radical scavenging potential of extracts was examined for selective samples via an on line validated LC-DPPH˙ method. Findings revealed that flavonoids and verbascoside, along with hydroxytyrosol, oleuropein and relevant components, significantly contribute to the overall antioxidant potential. Luteolin 7-O-glucoside and verbascoside were among extracts most dominant radical scavengers. Furthermore, in the present study a simple and reliable fluorimetric assay was developed and validated for the rapid determination of the total phenol content of polar extracts. The latter allowed an alternative way (instead of the tedious Folin Ciocalteu assay) of easy handling of the great number of unstable leaf extracts. The fluorimetric assay was also applied for optimal conditions determination (in terms of temperature, time, solvent, technique, leaf to solvent ratio) of leaf biophenol extraction. Commonly applied extraction approaches such as infusion, decoction and tincture preparations were found appropriate for the preparation of phenol rich antioxidant extracts. Such extracts presented similar phenolic profiles (total and individual) and radical scavenging activity. Moreover, leaf infusions, decoctions and tinctures were also found to act as antioxidants in a lipid model system, presenting inhibiting activity against liposomes oxidation. Last but not least, a first approach of the estimation of the safe use of leaf polar preparations was also made and results showed that no significant increase in the frequency of any category of mutant spots was recorded, independently of the concentrations of oleuropein and olive leaf extracts applied. Total phenol content and radical scavenging potential values seem to be safe criteria for the selection and appreciation of olive leaf batches for further usage. Olive leaf was found a robust source of phenolic antioxidants bearing individual secoiridoids, flavonoids and relevant constituents that significantly contribute to the overall antioxidant activity of the extracts. As a result, establishment of olive leaf as a stable source for radical scavengers all over the year seems to be promising for its commercialization.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η αξιολόγηση των φύλλων της Olea europea L. ως ετήσια πηγή φαινολικών αντιοξειδωτικών µε προοπτική την αξιοποίησή τους στην παραγωγή σκευασµάτων διατροφής µε λειτουργικές ιδιότητες. Στο πλαίσιο αναζήτησης και αξιοποίησης εναλλακτικών πηγών βιοενεργών συστατικών, το ενδιαφέρον στράφηκε στα φύλλα ελιάς πηγή: πλούσια σε φαινολικά οξέα, σεκοϊριδοειδή, φλαβονοειδή µε ποικίλες δράσεις, και βιοδιαθέσιµη και οικονομική που θα µπορούσε να αξιοποιηθεί ετησίως ως κύριο προϊόν του αείφυλλου ελαιοδένδρου και όχι µόνο εποχικά. Βασική προϋπόθεση για τη βιοµηχανική αξιοποίηση ενός φυτικού υλικού αποτελεί η εξασφάλιση προϊόντος σταθερού σε βιοενεργά συστατικά ή/και βιοενεργό δυναµικό. Αυτό εξαρτάται άμεσα από τα χαρακτηριστικά της πρώτης ύλης που υπόκειται στην επίδραση διάφορων βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων. ∆ιερευνώντας τη δυνατότητα ετήσιας αξιοποίησης των φύλλων ελιάς, μεγάλος αριθμός συστηµατικά συλλεγµένων δειγµάτων μελετήθηκε για εξακρίβωση της επίδρασης παραγόντων δειγµατοληψίας (ενδοποικιλιακή παραλλακτικότητα, ποικιλία, ηλικία φύλλων, εποχική διακύμανση, περιβάλλον ανάπτυξης) στη χημική σύσταση και αντιοξειδωτική ικανότητα του υλικού. Βασικό στοιχείο για την αξιολόγηση του αντιοξειδωτικού δυναµικού φυτικών εκχυλισµάτων είναι το περιεχόμενο τους σε ολικές φαινόλες (ΟΦ). Για το λόγο αυτό αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε αναλυτικό πρωτόκολλο µε φθορισµοµετρία, καθώς η διαχείριση και ανάλυση μεγάλου αριθμού ευοξείδωτων δειγµάτων απαιτούσε την εφαρμογή αξιόπιστης, εύχρηστης και γρήγορης δοκιμής. Η αξιολόγηση του αντιοξειδωτικού δυναµικού των φυτικών εκχυλισµάτων στηρίχθηκε: • στην εκτίμηση του περιεχομένου τους α) σε ΟΦ µε την εφαρμογή της Folin Ciocalteu και της φθορισµοµετρικής δοκιμής, και β) σε ολικά φλαβονοειδή µέσω χρωµατοµετρικής δοκιμής συµπλοκοποίησης φλαβονοειδών-μετάλλων, • στην υγροχρωµατογραφική εξέταση της σύστασής τους σε επιµέρους συστατικά, • στην εκτίμηση της ικανότητάς τους να δεσμεύουν ελεύθερες ρίζες µέσω της δοκιµής δέσμευσης της DPPH•. Άλλες in vitro δοκιμές δέσμευσης ελευθέρων ριζών χρησιμοποιήθηκαν επικουρικά, για τη σφαιρικότερη εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας του υλικού. Για την εκτίμηση της συνεισφοράς των επιµέρους συστατικών των εκχυλισµάτων στην ολική αντιοξειδωτική τους ικανότητα χρησιμοποιήθηκε on line ΗPLC-DPPH˙ μεθοδολογία. Επιπλέον, διερευνώντας την προοπτική αξιοποίησης του υλικού εξετάσθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητά του σε υποστρώµατα που προσομοιάζουν βιολογικά συστήματα και έγινε έλεγχος της ασφαλούς χρήσης του από τον άνθρωπο µέσω δοκιµής ελέγχου γονιδιοτοξικότητας (SMART test). Όλα τα ευρήματα οδήγησαν στην ενίσχυση της τεχνογνωσίας για την αξία του υλικού ως µια ιδιαίτερα καλή και σταθερή πηγή φαινολικών αντιοξειδωτικών και θεωρήθηκαν ιδιαίτερα ενθαρρυντικά για την βιοµηχανική αξιοποίηση: • του υλικού σε ετήσια βάση για την παραγωγή βιοενεργών προϊόντων (π.χ. σκευασµάτων διατροφής µε λειτουργικές ιδιότητες), • γρήγορης, απλής και αξιόπιστης φθορισµοµετρικής µεθόδου εκτίµησης ΟΦ πολικών φυτικών εκχυλισµάτων, ως δείκτη του βιοενεργού/αντιοξειδωτικού δυναµικού τους.