Ταυτοποίηση μεταβολιτών οξυγαλακτικών βακτηρίων σε μοντέλα εξομοίωσης ζυμωμένων τροφίμων

Abstract

Lactic acid bacteria (LAB) play an important role as natural food preservatives. However, the characterization of the variety of their metabolites is limited. In this PhD thesis, we studied the potential of four lactic acid bacteria, more specifically Lacticaseibacillus rhamnosus, Levilactobacillus brevis, Lactiplantibacillus plantarum and Lactobacillus gasseri. The present study investigated the antimicrobial activity of CFSs after 1th, 3th and 5th days incubation of LAB against four pathogenic bacteria (Salmonella enterica ATCC14028, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 and Escherichia coli ATCC 25922). The inhibition of active antimicrobial substances produced by different LAB species after 5 days incubation at 37 ◦C against pathogenic bacteria appeared to be similar. The specific LAB cultures inhibited the growth of Gram-negative and Gram-positive pathogens successfully, indicating that their addition to commercial foods can provide effective protection against infections caused by the specific pathogenic bacteria. Subsequently, their metabolites were identified by an optimized liquid chromatography with an ultraviolet/diode detection (HPLC-UV/DAD) method. The results of this study showed that the compound OH-PLA was identified in all four strains having the highest concentration of the rest of the phenolic substances. The highest concentration (253.0 ppm) was found in L. gasseri strain and the lowest (103.4 ppm) in L. brevis. A similar amount of vanillic acid (2.6 –3.4 ppm) was detected in L. brevis and L. plantarum respectively. Ferulic acid was isolated at different concentrations in L. rhamnosus and L. plantarum from 4.9 to 6.4. It was observed that the metabolites produced by the tested LAB species remained the same over a period of 30 days while the concentrations increased. Thus, metabolites could be identified from the first day of incubation of the microorganism. This study provides alternative approaches forthe molecules involved in the antimicrobial activity of food microorganism fermentation. These molecules may be used as antimicrobial ingredients in the food industry instead of conventional chemical preservatives. Subsequently, the ability of LAB to survive in the human intestine was determined. They were evaluated based on their tolerance to acids, resistance to simulated gastrointestinal conditions, antibiotic resistance, and the identification of genes encoding bacteriocin production. All four tested strains demonstrated high resistance to simulated gastric juice after 3 h, and the viable counts revealed declines in cell concentrations of less than 1 log cycle. L. plantarum showed the highest level of survival in the human gut, with counts of7.09 log CFU/mL. For the species L. rhamnosus and L. brevis, the values were 6.97 and 6.52, respectively. L. gasseri, after 12 h, showed a 3.96 log cycle drop in viable counts. Regarding bacteriocin genes, PlnA and Brevicin 174A genes were not detected in any bacteria. On the contrary, Pediocin PA gene was identified in L. plantarum, L. rhamnosus, and L. gasseri. The PlnEF gene was detected in L. plantarum and L. rhamnosus. At the same time, the sensitivity of LAB to eight antibiotics was evaluated for each of the following substances: ampicillin, gentamicin, kanamycin, streptomycin, erythromycin, clindamycin, tetracycline and chloramphenicol. In addition, the MIC of the antimicrobial substances expressed in μg/mL was determined by the ETEST Gradient strip method. Microbiological limit values are set by EFSA. None of the evaluated strains inhibited resistance to the aforementioned antibiotics. In the context of this PhD thesis, the in vitro antioxidant activity of LAB was determined using the free radical DDPH• and then evaluated with regard to their radical scavenging activity and inhibition against peroxyl radical induced DNA scission. All strains showed antioxidant activity. However, the best antioxidant activity was obtained by L. brevis (94.47%) and L. gasseri (91.29%) at 210 min. In addition, the potential antioxidant activity of LAB metabolites was evaluated. This PhD thesis extensively studied the aforementioned LAB strains from the identification of the metabolites they produce, their antimicrobial activity, probiotic and antioxidant potential. In the end, after it was checked that they are safe to use in food due to their sensitivity to antibiotics (they do not contain resistance genes that can be transferred to humans), they were used as initial starter cultures in the Greek-type fermentation of black olives (kalamon) (L. rhamnosus, L. brevis, and L. plantarum). The microbial community found in the olive, at the final stage of fermentation (150 days), was determined by the next generation sequencing (NGS) method. According to the findings, the most abundant genera were Lactobacillus and Leuconostoc. Regarding the organoleptic characteristics of fermentation, there were no off odors that indicate abnormal fermentation (i.e., butyric, putrid fermentation) or other defects detected by the panelists in any group of the fermented olives. In particular, the fermentations with the addition of L. rhamnosus and L. brevis showed the higher score for saltiness compared to the natural fermentation of the endogenous microflora of the olive (control) (p<0.05). In addition, the gustatory sensation evaluation showed that the L. rhamnosus- and L. brevis-fermented groups scored higher in bitterness than the L. plantarum-fermented group and the control group (p < 0.05, respectively). In the evaluation of the acidic taste, no significant differences were observed. However, the L. rhamnosus fermented group scored higher in fibrousness evaluation according to the panelists compared to the control group (p<0.05). Additionally, the L. plantarum-fermented group had higher scores in the kinesthetic sensation of hardness and crunchiness compared to the other fermented groups (p<0.05). To our knowledge, this is the first study exploring these particular starters with probiotic potential for the fermentation of olives. This study provides a comprehensive approach to the action of these LAB and their use in the food industry. The main metabolites in each fermentation process were identified using an HPLC method. The results showed that the concentration of metabolites increased gradually, developing a stable pattern after the 90th day of fermentation. Also, OH-PLA was identified as the phenolic acid with the highest concentration, regardless of the selected starter culture.

Τα βακτήρια γαλακτικού οξέος (LAB) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο ως φυσικά συντηρητικά τροφίμων. Ωστόσο, ο χαρακτηρισμός των μεταβολιτών τους είναι περιορισμένος. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήσαμε το δυναμικό τεσσάρων οξυγαλακτικών βακτηρίων, πιο συγκεκριμένα μελετήθηκαν τα στελέχη Lacticaseibacillus rhamnosus, Levilactobacillus brevis, Lactiplantibacillus plantarum και Lactobacillus gasseri. Ο πρωταρχικός στόχος αυτής της μελέτης ήταν η μελέτη της αντιμικροβιακής δράση των CFS μετά από επώαση 1ης, 3ης και 5ης ημέρας των LAB έναντι τεσσάρων παθογόνων βακτηρίων (Salmonella enterica ATCC14028, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 and Escherichia coli ATCC 25922). Η αναστολή των ενεργών αντιμικροβιακών ουσιών που παράγονται από διαφορετικά είδη LAB μετά από επώαση 5 ημερών στους 37 ◦C έναντι παθογόνων βακτηρίων φάνηκε να είναι παρόμοια. Οι συγκεκριμένες καλλιέργειες LAB ανέστειλαν την ανάπτυξη των Gram-αρνητικών και Gram- θετικών παθογόνων με επιτυχία, υποδεικνύοντας ότι η προσθήκη τους σε εμπορικά τρόφιμα μπορεί να παρέχει αποτελεσματική προστασία έναντι λοιμώξεων που προκαλούνται από τα συγκεκριμένα παθογόνα βακτήρια. Στη συνέχεια έγινε ταυτοποίηση των μεταβολιτών τους με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης με ανίχνευτη υπεριώδους/συστοιχίας διόδων (HPLC-UV/DAD). Tα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι η ένωση OH-PLA ταυτοποιήθηκε και στα τέσσερα στελέχη έχοντας και την υψηλότερη συγκέντρωση από τις υπόλοιπες φαινολικές ουσίες. Η υψηλότερη συγκέντρωση (253.0 ppm) βρέθηκε στο στέλεχος L. gasseri και η χαμηλότερη (103.4 ppm) στο L. brevis. Παρόμοια ποσότητα vanillic acid (2.6 – 3.4 ppm) εντοπίστηκε σε L. brevis και L. plantarum αντίστοιχα. Το ferulic acid απομονώθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε L. rhamnosus και L. plantarum από 4.9 έως 6.4. Παρατηρήθηκε ότι οι μεταβολίτες που παρήχθησαν από τα LAB παρέμειναν οι ίδιοι σε διάστημα 30 ημερών, ενώ οι συγκεντρώσεις κατά το πέρας των ημερών αυξανόντουσαν. Έτσι, οι μεταβολίτες μπορούσαν να αναγνωριστούν από την πρώτη ημέρα της επώασης του μικροοργανισμού. Αυτή η μελέτη παρέχει εναλλακτικές προσεγγίσεις για τους μεταβολίτες που εμπλέκονται στην αντιμικροβιακή δράση της ζύμωσης μικροοργανισμών τροφίμων. Αυτές οι ουσίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιμικροβιακά συστατικά στη βιομηχανία τροφίμων αντί για συμβατικά χημικά συντηρητικά. Μετέπειτα προσδιορίσθηκε η ικανότητά των LAB να επιβιώσουν στο ανθρώπινο έντερο. Αξιολογήθηκε με βάση την ανοχή τους στα οξέα, την αντίστασή τους σε προσομοιωμένες γαστρεντερικές καταστάσεις, την αντίσταση στα αντιβιοτικά και την ταυτοποίηση γονιδίων που κωδικοποιούν την παραγωγή βακτηριοσινών. Παρατηρήθηκε ότι και τα τέσσερα στελέχη έδειξαν υψηλή αντοχή στο προσομοιωμένο γαστρικό υγρό μετά από 3 ώρες και οι μετρήσεις των αποικιών έδειξαν μειώσεις στις κυτταρικές συγκεντρώσεις μικρότερες από 1 log κύκλου. Το L. plantarum έδειξε το υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης στις προσομοιώσεις του ανθρώπινου έντερου, με μετρήσεις 7.09 log CFU/mL. Για τα είδη L. rhamnosus και L. brevis, οι τιμές ήταν 6.97 και 6.52, αντίστοιχα. Το L. gasseri, μετά από 12 ώρες, έδειξε πτώση κατά 3.96 log CFU/mL. Όσον αφορά τα γονίδια βακτηριοσίνης, τα γονιδία PlnA και Βrevicin174A δεν ανιχνεύθηκαν σε κανένα στέλεχος. Αντίθετα, γονίδιο Pediocin PA ανιχνεύθηκε στα στελέχη L. plantarum, L. rhamnosus και L. gasseri. Επιπλέον, ανιχνεύθηκε η παρουσία του γονιδίου plnEF στο στέλεχος L. plantarum και L. rhamnosus. Παράλληλα αξιολογήθηκε η ευαισθησία των LAB σε οκτώ αντιβιοτικά για καθεμία από τις ακόλουθες ουσίες: αμπικιλλίνη, γενταμυκίνη, καναμυκίνη, στρεπτομυκίνη, ερυθρομυκίνη, κλινδαμυκίνη, τετρακυκλίνη και χλωραμφενικόλη. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η MIC των αντιμικροβιακών ουσιών που εκφράζεται σε μg/mL με την μέθοδο ETEST Gradient strip. Οι μικροβιολογικές οριακές τιμές καθορίζονται από τον EFSA. Κανένα από τα αξιολογηθέντα στελέχη δεν ανέστειλε την αντίσταση στα προαναφερθέντα αντιβιοτικά. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, έγινε προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής δραστηριότητας in vitro των LAB με τη μέθοδο Scavenging of a, a-Diphenyl-β- Picrylhydrazyl (DDPH) Free Radical. Η αποτελεσματικότητα των CFSs των οξυγαλακτικών βακτηρίων μελετήθηκε και με τη μέθοδο κοπής DNA που προκαλείται από τη ρίζα υπεροξυλίου. Όλα τα στελέχη έδειξαν αντιοξειδωτική δράση. Ωστόσο, η καλύτερη αντιοξειδωτική δράση επιτεύχθηκε από τα L. brevis (94.47%) και L. gasseri (91.29%) στα 210 λεπτά. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η πιθανή αντιοξειδωτική δράση των μεταβολιτών των LAB. Η παρούσα διδακτορική διατριβή μελέτησε εκτενώς τα προαναφερθείσα στελέχη LAB από την ταυτοποίηση των μεταβολιτών που παράγουν, την αντιμικροβιακή δράση, το προβιοτικό και αντιοξειδωτικό δυναμικό τους. Στο τέλος, αφού ελέγχθηκε ότι είναι ασφαλής η χρήση τους στα τρόφιμα λόγω της ευαισθησίας τους στα αντιβιοτικά (δεν περιέχουν γονίδια αντοχής που μπορούν να μεταφερθούν στον άνθρωπο), χρησιμοποιήθηκαν ως αρχικές καλλιέργειες εκκίνησης στην ελληνικού τύπου ζύμωση σε μαύρες ελιές τύπου καλαμών (L.rhamnosus, L. brevis, και L. plantarum). Έγινε προσδιορισμός της μικροβιακής κοινότητας που βρέθηκε στην ελιά, στο τελικό στάδιο της ζύμωσης (150 ημέρες) με τη μέθοδο αλληλούχισης της επόμενης γενιάς (NGS). Σύμφωνα με τα ευρήματα, τα πιο άφθονα γένη ήταν οι Lactobacillus και Leuconostoc. Όσον αφορά δε τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά της ζύμωσης, δεν εντοπίστηκαν δυσάρεστες οσμές που υποδεικνύουν ανώμαλη ζύμωση (abnormal fermentation) (δηλαδή βουτυρική, σάπια ζύμωση) ή άλλα ελαττώματα από τους συμμετέχοντες σε οποιαδήποτε ομάδα ελιών που έχουν υποστεί ζύμωση. Συγκεκριμένα, η ζύμωση με την προσθήκη εναρκτήριας καλλιέργειας L. rhamnosus και εναρκτήριας καλλιέργειας L. brevis έδειξε την υψηλότερη βαθμολογία στην αξιολόγηση αλατότητας (salty) σε σύγκριση με τη φυσική ζύμωση της ενδογενής μικροχλωρίδας της ελιάς (control) (p<0.05). Επιπρόσθετα, η αξιολόγηση των γευστικών αισθήσεων έδειξε ότι οι ζυμώσεις με την προσθήκη L. rhamnosus και L. brevis σημείωσε υψηλότερη βαθμολογία σε πικρία (bitter) από τη ζύμωση με την προσθήκη L. plantarum και τη φυσική ζύμωση με την ενδογενή μικροχλωρίδα της ελιάς (p<0.05 αντίστοιχα). Όσον αφορά την αξιολόγηση της όξινης γεύσης (Acid), δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στις ζυμώσεις. Περαιτέρω, η ομάδα που υποβλήθηκε σε ζύμωση με την προσθήκη L.Rhamnosus, σημείωσε υψηλότερη βαθμολογία στην αξιολόγηση των ινώσεων (fibrousness) σύμφωνα με τους συμμετέχοντες σε σύγκριση με τη φυσική ζύμωση της ενδογενής μικροχλωρίδας της ελιάς (control) (ρ<0.05). Προσθέτω επίσης στο σημείο αυτό ότι, η ζύμωση με την προσθήκη L. plantarum είχε υψηλότερες βαθμολογίες στην κιναισθητική αίσθηση σκληρότητας (hardness) και τραγανότητας (crunchiness) σε σύγκριση με τα άλλα είδη ζυμώσεων (p<0.05). Απ’ όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που διερευνά αυτά τα συγκεκριμένα στελέχη για τη ζύμωση της ελιάς. Αυτή η μελέτη παρέχει μια ολοκληρωμένη προσέγγιση για τη δράση αυτών των LAB και τη χρήση τους στη βιομηχανία τροφίμων. Οι κύριοι μεταβολίτες σε κάθε διαδικασία ζύμωσης αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο HPLC. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συγκέντρωση των μεταβολιτών αυξήθηκε σταδιακά, αναπτύσσοντας ένα σταθερό πρότυπο μετά την 90η ημέρα της ζύμωσης. Καθώς επίσης, το OH-PLA αναγνωρίστηκε ως το φαινολικό οξύ με την υψηλότερη συγκέντρωση, ανεξάρτητα από την επιλεγμένη καλλιέργεια εκκίνησης.