Μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθειών με χρήση δεικτών μοριακής βιολογίας

Abstract

The presence of free nucleic acids in the peripheral circulationhas been known since 1948. However no research on this area wascarried out at the time of the discovery due to the lack of sufficientlyadvanced technology.The first results regarding the clinical value of free nucleic acidscame to light in the literature 30 years after their original discovery. Thiswas first reported in studies of autoimmune disorders in which themechanism of their release in the peripheral blood was studied as wellas their potential role in the sensitization of the immune system and anypossible correlation between their concentration and the clinicaloutcome. Interest was intensified when in 1977 Leon et al announcedthat levels of cell free DNA may have some clinical prognostic value forthe severity of cancer in suffering patients.Presently there is great research effort worldwide in progress toutilize the cell free fetal DNA as material for non-invasive PrenatalDiagnosis for inherited disorders, or as a prognostic marker forpathological conditions (i.e. aneuploidies and proeclampsia) in high riskpregnancies.The eventual outcome of these efforts will also have an effect ontesting of the monogenic inherited disorders such as thalassemia majorand cystic fibrosis.Efforts have focused, for this reason, in the development of quicksensitive and low cost protocols for both qualitative and quantitativedetection. The protocol design is of great importance in order to achievethe detection of circulating fetal material and overcome the technical difficulties that we are facing today.In many European countries, including Greece, sex determinationand RhD status are carried out with non-invasive techniques on aroutine basis by Government laboratories using as starting materialplasma from maternal peripheral blood.In the present study, after testing several existing technologies, asensitive and reliable Polymerase Chain Reaction was developed withLNA modified primers and detection by Fragment Analysis fluorescentPCR for detecting paternally inherited mutations in the ffDNA. As amodel disease we used thalassemia major.Advantages of the method include the rapid analysis andprocessing of the results and the high sensitivity of the reaction that candetect 6.6 pg of fetal DNA in the maternal sample.

Η ύπαρξη ελεύθερων νουκλεϊκών οξέων στην περιφερικήκυκλοφορία είναι γνωστή από το 1948. Δεν αποτέλεσαν όμωςαντικείμενο περαιτέρω μελέτης, άμεσα, κυρίως λόγω της έλλειψηςτεχνολογίας, την εποχή της ανακάλυψης τους, που θα επέτρεπε τηνμέτρηση των επιπέδων τους ή την ανίχνευση τους.Στη βιβλιογραφία συναντάμε τα πρώτα αποτελέσματα αναφορικάμε την κλινική αξία των ελεύθερων νουκλεϊκών οξέων 30 χρόνια μετάτην ανακάλυψή τους. Πρόκειται για μελέτες αυτοάνοσων νοσημάτων,στις οποίες διερευνήθηκε τόσο ο μηχανισμός προέλευσής τους, ο ρόλοςτους στο μηχανισμό ευαισθητοποίησης του ανοσοποιητικού, όσο και ησυσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσής τους στην περιφερική κυκλοφορίαμε την έκβαση ή την βαρύτητα συγκεκριμένων ασθενειών.Το ερευνητικό ενδιαφέρον ενισχύθηκε όταν το 1977 ο Leon καισυνεργάτες ανακοίνωσαν πως η μέτρηση των επιπέδων του ελεύθερουDNA ενδέχεται να έχει προγνωστική αξία, για την βαρύτητα της νόσουστους ασθενείς με καρκίνο. Σήμερα, διερευνάται με έντονους ρυθμούςκαι με συντονισμένες σε διεθνές επίπεδο προσπάθειες, η χρήση τουελεύθερου εμβρυϊκού DNA σαν υλικό για την μη επεμβατικήπρογεννητική διάγνωση παθολογικών κυήσεων (NIPD-Non InvasivePrenatal Diagnosis). Οι μελέτες αυτού του είδους αναμένεται ναπροάγουν την ανάπτυξη μη επεμβατικών διαγνωστικών πρωτοκόλλωνκαι για μονογονιδιακά κληρονομικά νοσήματα (Μεσογειακή αναιμία,Κυστική Ίνωση) καθώς και προγνωστικών εργαλείων σε διάφορεςπαθολογικές καταστάσεις (προεκλαμψία, ανευπλοειδικές κυήσεις) σεκυήσεις υψηλού κινδύνου. Για το λόγο αυτό, τα τελευταία χρόνια, έχουν καταβληθεί μεγάλες προσπάθειες για την ανάπτυξη γρήγορων,ευαίσθητων και χαμηλού κόστους μεθόδων ποσοτικής και ποιοτικήςανάλυσης. Μεγάλης σημασίας είναι ο σχεδιασμός του πρωτοκόλλουώστε να επιτευχθεί η ανίχνευση του εμβρυικού υλικού ξεπερνώντας τιςτεχνικές δυσκολίες που υπάρχουν σήμερα. Σε διάφορες ευρωπαϊκές χώρες και στην Ελλάδα, χρησιμοποιείταιήδη σε διαγνωστικό επίπεδο ο μη επεμβατικός έλεγχος για τονπαράγοντα Ρέζους (RhD) καθώς και ο φυλοκαθορισμός του εμβρύουαπό κρατικά εργαστήρια χρησιμοποιώντας ως αρχικό υλικό το πλάσματης μητέρας.Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, αναπτύχθηκε μετά απόδοκιμές αρκετών γνωστών τεχνολογιών, μια ευαίσθητη και αξιόπιστηαλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης παραλλαγή της ARMS PCR μεενσωματωμένα κλειδωμένα νουκλεϊκά οξέα (LNAs) και ανάλυση μεχρήση ανάλυσης θραυσμάτων (Fragment Analysis), για την ανίχνευσημεταλλαγών ελεύθερου εμβρυικού DNA στην κυκλοφορία της εγκύου.Πλεονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν η ταχεία επεξεργασία τωναποτελεσμάτων και η ευαισθησία της τεχνικής (δυνατότητα μέτρησης6.6 pg DNA σε πολύ μεγαλύτερη ποσότητα μητρικού DNA).