Ρόλος των ιστονικών τροποποιήσεων και ισομορφών στο φαινόμενο της ρετρομετάθεσης

Abstract

The purpose of the current study was to investigate the role of histone modifications in the retrotransposition phenomenons. To this end, we constructed cellular assays to measure the transcription activity and retrotransposition frequency of VL30 , through luciferase and EGFP expression, respectively. We evidenced that oncogenic stress, SV40 large T antigen, c-myc and a dominant negative p53- gene, induced VL30 retrotransposition. Regarding histone acetylation trichostatin A, a histone deacetylase inhibitorinduced both VL30 transcription and retrotransposition. In contrast, histone acetyl-transferase CBP induced only retrotransposition. We found that oxidative stress, by hydrogen peroxide or heavy metals vanadium and arsenic induced retrotransposition frequency in high levels. Metal-induced oxidative stress resulted in high induction of VL30 transcription and N-acetyl-cysteine or desferioxamine, protective agents of oxidative stress, strongly inhibited both transcription and retrotransposition frequency. By ectopic expression of MAP kinase genes ERK-2, JNK and p38, we showed that MAPKs induce both VL30 transcription and retrotransposition, which is consistent with the role of histone phosphorylation on immediate early genes, such as VL30s. We showed that a constitutively active kinase IKKα induced VL30 transcription and retrotransposition in high levels. The specificity of IKKα-induced retrotransposition was confirmed through Efavirenz, an enRTs inhibitor, and NAC or DFO, known to inhibit kinases. Through chromatin immunoprecipitation, we found induced phosphorylation of histone H3S10, a euchromatinization mark, in the cases of arsenic and histone kinase IKKα. These results highlight that H3S10 phosphorylation is a critical modification in the epigenetic regulation of VL30 retrotransposition. In agreement with the above, retrotransposition events were found to occur spontaneously in embryonic stem cells, especially during early differentiation/H3S10 phosphorylation. We studied the effects of induced retrotransposition and found that high retrotransposition frequency is correlated with induced cell death. Cells surviving cell death form cell foci and exhibit distinct alterations of cell phenotype. These results provide strong evidence that retrotransposon integrations/mutations, potentially lead to cell transformation. On the whole, we correlate histone modifications with regulation of retrotransposition phenomenon. Additionally H3S10 phosphorylation, as a primary and concurrent event on VL30-chromatin, can induce alterations in normal cell physiology through retrotransposition.

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η συσχέτιση των ιστονικών τροποποιήσεων με το φαινόμενο της ρετρομετάθεσης. Κατασκευάσαμε κυτταρικά συστήματα μέτρησης της μεταγραφικής ενεργότητας και της συχνότητας ρετρομετάθεσης των ρετροτρανσποζονίων VL30, μέσω λουσιφεράσης και της EGFP, αντίστοιχα. Αποδείξαμε ότι ογκογόνο στρες από το μεγάλο Τ αντιγόνο (SV40), το ογκογονίδιο c-myc και μία αρνητικά επικρατούσα p53- επάγει τη ρετρομετάθεση VL30. Κάνοντας επαγωγή ιστονικής ακετυλίωσης, βρήκαμε ότι η δράση του αναστολέα των αποακετυλασών, τριχοστατίνης Α, επήγαγε τη μεταγραφή και τη ρετρομετάθεση, ενώ η ακετυλομεταφοράση CBP επήγαγε μόνο τη ρετρομετάθεση VL30. Παρατηρήσαμε ότι το οξειδωτικό στρες από υπεροξείδιο του υδρογόνου και τα βαρέα μέταλλα βανάδιο και αρσενικό επήγαγε ισχυρά τη συχνότητα ρετρομετάθεσης, ενώ το μεταλλο-επαγώμενο οξειδωτικό στρες επήγαγε ισχυρά τη μεταγραφή VL30. Επιπλέον, οι παράγοντες προστασίας οξείδωσης Ν-ακετυλο-κυστεΐνη (NAC) και δεσφεριοξαμίνη (DFO), ανέστειλαν ισχυρά τη μεταγραφή και τη ρετρομετάθεση. Μέσω εκτοπικής έκφρασης των ERK-2, JNK και p38, αποδείξαμε ότι οι MAP κινάσες επάγουν ισχυρά τη μεταγραφή και ρετρομετάθεσης, συμφωνώντας με το ρόλο της ιστονικής φωσφορυλίωσης σε γονίδια πρώιμης απόκρισης, όπως τα VL30. Κάνοντας χρήση μίας συνεχώς ενεργούς κινάσης ΙΚΚα, αποδείξαμε ότι επήγαγε ισχυρά τη μεταγραφή και τη ρετρομετάθεση VL30 και στοιχειοθετήσαμε την ειδικότητα της μέσω αναστολής από τον αναστολέα enRTs, Efavirenz και τους παράγοντες NAC ή DFO που αναστέλλουν κινάσες. Μέσω ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης στο VL30-LTR ανιχνεύσαμε επαγωγή φωσφορυλιωμένης H3S10, ευχρωματινικού δεικτη, στις περιπτώσεις του αρσενικού και της κινάσης ιστονών, ΙΚΚα. Αυτό ανέδειξε τη φωσφορυλίωση της Η3S10 ως κεντρικό γεγονός στην επιγενετική ρύθμιση της ρετρομετάθεσης VL30. Σε συμφωνία με το ανωτέρω, αποτελέσματα μας στο περιβάλλον των εμβρϋικών βλαστικών κυττάρων, απέδειξαν ότι επιτρέπει δυνητικά την τέλεση γεγονότων ρετρομετάθεσης, ιδιαίτερα κατά την πρώιμη διαφοροποίηση/φωσφορυλίωση H3S10. Μελετώντας τις επιπτώσεις της ρετρομετάθεσης στο κύτταρο βρήκαμε ότι αυξημένα ποσοστά ρετρομετάθεσης συσχετίζονται με κυτταρικό θανάτο. Κύτταρα που ανθίστανται του κυτταρικού θανάτου, σχηματίζουν κυτταρικές εστίες (foci) και χαρακτηρίζονται από μεταβολή κυτταρικού φαινότυπου. Τα ευρήματα αυτά αποτελούν ενδείξεις ότι η συσσώρευση ρετρομεταθέσεων/μεταλλάξεων δυνητικά οδηγεί σε κυτταρικό μετασχηματισμό. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι οι ιστονικές τροποιήσεις, συσχετίζονται άμεσα με τη ρύθμιση του φαινομένου της ρετρομετάθεσης και ειδικότερα η φωσφορυλίωση της H3S10 ως συνεχές και επαναλαμβανόμενο γεγονός, μπορεί να προκαλέσει αλλαγή της κυτταρικής φυσιολογίας, μέσω ρετρομετάθεσης.