Διερεύνηση της χρήσης των ελεύθερων νουκλεϊνικών οξέων (cell free DNA & miRNAs) στο καλλιεργητικό υλικό των εμβρύων ως προγνωστικών δεικτών της ποιότητας των εμβρύων και της δυνατότητας εμφύτευσης τους

Abstract

The selection of suitable embryos for transfer is a major challenge faced by clinical embryologists worldwide from the very first years of assisted reproduction until today. Various techniques and methods have been developed, and new ones are constantly being investigated so that it becomes possible to select those embryos that will have the potential to lead to a successful pregnancy and, ultimately, to the birth of healthy babies. The approaches that have been developed can be divided into two broad categories, invasive and non-invasive. The global trend, of course, is the introduction into clinical practice of non-invasive embryo selection procedures, which are free from the negative effects of invasive techniques, so that it is possible to select only one healthy embryo at a time, increasing the rates of pregnancies and healthy births without the risks of multiple pregnancies.In recent years, our understanding of the biology of free nucleic acids such as cell-free DNA (cfDNA) and microRNAs (miRNAs) has advanced greatly, and powerful technologies for their analysis have been developed. Many research studies report the use of these molecules as prognostic tools for various forms of cancer, ovarian and endometrial disorders, in the diagnosis of aneuploidy in embryos, but also in monitoring the health of embryos before implantation in Assisted Reproduction procedures.In this specific work, the free nucleic acids, cfDNA and microRNAs, which are released in the culture material of human embryos in the laboratory (Spend Culture Medium, SCM) in the context of the application of Assisted Reproduction techniques, are investigated. In principle, the purpose of this study is to test whether nucleic acids can be harvested from the culture material, isolated, and amplified. In the second phase, the aim is to investigate whether these nucleic acids released in the culture material can be correlated with the chromosomal profile of the embryos that have been derived from the genetic analysis of the trophectoderm biopsies of the corresponding embryos, to be used as non-invasive markers for preimplantation diagnosis.A total of 130 samples were studied, 65 for cell-free DNA and 65 for microRNAs. Of these, 50 samples were used to determine the conditions of the experiment. For cf-DNA, 40/40 samples were amplified by whole genome amplification (WGA) and analyzed by NGS. Samples from the SCM were compared with results from trophectoderm biopsies of the corresponding embryos. The percentage of complete agreement between invasive (i) PGT-A and non-invasive (ni) PGT-A of the corresponding fetuses was 63.6%. The percentage of the overall agreement (euploid or aneuploid profile) between iPGT-A and niPGT-A of the corresponding embryos was 81.8%. The race chromosome concordance rate between iPGT-A and niPGT-A was 100%.For the final study of microRNAs, 40 samples were used, 50% euploid and 50% aneuploid. Eight miRNAs were studied, but only five were isolated and amplified, miR-20a-5p, miR-518d-5p, miR-196a-5p, miR-191-5p, miR-372-3p, while no isolation and amplification were observed of miR-661, miR-142-3p and miR-30c-5p molecules in none of the 40 samples studied. MiR-20a-5p was detected with a higher frequency in culture medium collected from euploid embryos, with a statistically significant difference, p=0,05. MiR-518d-5p is detected only in culture medium collected from euploid embryos but at a low frequency, p=0,0602. MiR-196a-5p is detected in culture medium collected from all embryos, regardless of their ploidy profile. miR-191-5p occurs at a slightly increased rate in euploid embryo culture medium but not with a statistically significant difference, p=0,0619. MiR-372-3p occurs at a significantly higher detection rate in euploid embryo culture medium, with a statistically significant difference, p=0,0210.In this study, indeed, it became possible to isolate and analyze cfDNA and some microRNAs and correlate them with the chromosomal profile of the corresponding embryos. The small number of samples is a limitation; however, with regard to niPGTA, an analysis of the genetic composition of whole blastocysts was also performed, which is the gold standard for determining the accuracy and reliability of this methodology. Despite the limitations, from this study, it can be confirmed that niPGT-A is reliable and accurate and can be used, at least alongside invasive PGTA, as an alternative, especially in cases of mosaicism. Regarding microRNAs, some of those studied seem to be able to be used as strong molecular prognostic indicators of the chromosomal profile of the corresponding embryos. Large-scale randomized control studies will be able to validate this promising methodology.This specific research study has been approved by the Ethics Committee of the Democritus University of Thrace.

Η επιλογή των κατάλληλων εμβρύων για μεταφορά αποτελεί μια μεγάλη πρόκληση που καλούνται να αντιμετωπίσουν οι κλινικοί εμβρυολόγοι παγκοσμίως από τα πρώτα κιόλας χρόνια εφαρμογής της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής, μέχρι σήμερα. Διάφορες τεχνικές και μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί και συνεχώς διερευνώνται καινούργιες, ώστε να γίνει εφικτή η επιλογή εκείνων των εμβρύων που θα έχουν το δυναμικό να οδηγήσουν σε επιτυχημένη κύηση και τελικά στην γέννηση υγιών μωρών. Οι προσεγγίσεις που έχουν αναπτυχθεί μπορούν να χωριστούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες, στις επεμβατικές και τις μη επεμβατικές. Η παγκόσμια τάση βέβαια είναι η εισαγωγή στην κλινική πράξη μη επεμβατικών διαδικασιών επιλογής εμβρύων, οι οποίες είναι απαλλαγμένες από τις αρνητικές επιδράσεις των επεμβατικών τεχνικών, ώστε να είναι δυνατή η επιλογή ενός και μόνο υγιούς εμβρύου κάθε φορά, αυξάνοντας τα ποσοστά κυήσεων και υγιών γεννήσεων χωρίς τους κινδύνους μιας πολύδυμης εγκυμοσύνης. Τα τελευταία χρόνια, η κατανόησή μας για τη βιολογία των ελεύθερων νουκλεϊκών οξέων, όπως το cell free DNA (cfDNA) και τα microRNAs (miRNAs) έχει προχωρήσει πολύ και έχουν αναπτυχθεί ισχυρές τεχνολογίες για την ανάλυσή τους. Πολλές ερευνητικές μελέτες αναφέρουν την χρήση αυτών των μορίων ως προγνωστικά εργαλεία διαφόρων μορφών καρκίνου, διαταραχών στις ωοθήκες και το ενδομήτριο, στην διάγνωση ανευπλοειδιών στα έμβρυα, αλλά και στην παρακολούθηση της υγείας των εμβρύων πριν την εμφύτευση στις διαδικασίες Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής.Στην συγκεκριμένη εργασία διερευνώνται τα ελεύθερα νουκλεϊκά οξέα, cfDNA και microRNAs, τα οποία απελευθερώνονται στο καλλιεργητικό υλικό ανθρώπινων εμβρύων στο εργαστήριο, (Spend Culture Medium, SCM), στα πλαίσια εφαρμογής τεχνικών Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής. Καταρχήν, σκοπός αυτής της μελέτης είναι να ελεγχθεί αν τα νουκλεϊκά οξέα μπορούν να συλλεχθούν από το καλλιεργητικό υλικό, να απομονωθούν και να ενισχυθούν. Σε δεύτερη φάση, στόχος είναι να διερευνηθεί αν αυτά τα νουκλεϊκά οξέα που απελευθερώνονται στο καλλιεργητικό υλικό μπορούν να συσχετιστούν με το χρωμοσωμικό προφίλ των εμβρύων που έχει προκύψει από την γενετική ανάλυση των βιοψιών τροφοεκτοδέρματος των αντίστοιχων εμβρύων, ώστε να χρησιμοποιηθούν ως μη επεμβατικοί δείκτες προεμφυτευτικής διάγνωσης. Μελετήθηκαν συνολικά 130 δείγματα, 65 για το cell free DNA και 65 για τα microRNAs. Εξ αυτών, 50 δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για το καθορισμό των συνθηκών του πειράματος. Για το cf-DNA, 40/40 δείγματα ενισχύθηκαν μέσω ολικής ενίσχυσης γονιδίωματος (WGA) και αναλύθηκαν μέσω NGS. Τα δείγματα από το SCM συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα από τις βιοψίες τροφοεκτοδέρματος των αντίστοιχων εμβρύων. Το ποσοστό πλήρους συμφωνίας μεταξύ του επεμβατικού (invasive, i,) PGT-A και του μη επεμβατικού (non invasive, ni) PGT-A των αντίστοιχων εμβρύων ήταν 63,6%. Το ποσοστό συνολικής συμφωνίας (ευπλοειδικό ή ανευπλοεικό προφίλ) μεταξύ iPGT-A και niPGT-A των αντίστοιχων εμβρύων ήταν 81,8%. Το ποσοστό συμφωνίας των φυλετικών χρωμοσωμάτων μεταξύ iPGT-A και niPGT-A ήταν 100%.Για την τελική μελέτη των microRNAs χρησιμοποιήθηκαν 40 δείγματα, 50% ευπλοειδικά και 50% ανευπλοειδικά. Μελετήθηκαν οχτώ miRNAs, αλλά πραγματοποιήθηκε απομόνωση και ενίσχυση στα πέντε μόνο, τα miR-20a-5p, miR-518d-5p, miR-196a-5p, miR-191-5p, miR-372-3p, ενώ δεν παρατηρήθηκε απομόνωση και ενίσχυση των μορίων miR-661, miR-142-3p και miR-30c-5p σε κανένα από τα 40 δείγματα που μελετήθηκαν. Το miR-20a-5p ανιχνεύεται με μεγαλύτερη συχνότητα στο καλλιεργητικό υλικό που συλλέχθηκε από ευπλοειδικά έμβρυα, με στατιστικά σημαντική διαφορά, p=0,05. Το miR-518d-5p ανιχνεύεται μόνο στο καλλιεργητικό υλικό που συλλέχθηκε από ευπλοειδικά έμβρυα, αλλά σε χαμηλή συχνότητα, p=0,0602. Το miR-196a-5p ανιχνεύεται στο καλλιεργητικό υλικό που συλλέχθηκε από όλα τα έμβρυα, ανεξαρτήτως του πλοειδικού τους προφίλ. Το miR-191-5p εμφανίζεται με ελαφρώς αυξημένο ποσοστό στο καλλιεργητικό υλικό ευπλοειδικών εμβρύων, αλλά όχι με στατιστικά σημαντική διαφορά, p=0,0619. Το miR-372-3p εμφανίζεται με σημαντικά υψηλότερο ρυθμό ανίχνευσης στο καλλιεργητικό υλικό ευπλοειδών εμβρύων, με στατιστικά σημαντική διαφορά, p=0,0210.Σε αυτή τη μελέτη, πράγματι, κατέστη εφικτή η απομόνωση και ανάλυση του cfDNA και κάποιων microRNAs και ο συσχετισμός τους με το χρωμοσωμικό προφίλ των αντίστοιχων εμβρύων. Ο μικρός αριθμός των δειγμάτων είναι ένας περιορισμός, ωστόσο όσον αφορά το niPGTA έγινε και ανάλυση της γενετικής σύνθεσης ολόκληρων βλαστοκύστεων που αποτελεί το gold standard για τον προσδιορισμό της ακρίβειας και αξιοπιστίας αυτής της μεθοδολογίας. Παρά τους περιορισμούς, από αυτήν τη μελέτη μπορεί να επιβεβαιωθεί ότι το niPGT-A, είναι αξιόπιστο και ακριβές και μπορεί να χρησιμοποιηθεί, τουλάχιστον παράλληλα με το επεμβατικό PGTA ως εναλλακτική λύση, ειδικά σε περιπτώσεις μωσαϊκισμού. Όσον αφορά τα microRNAs, κάποια από αυτά που μελετήθηκαν φαίνεται να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ισχυροί μοριακοί προγνωστικοί δείκτες του χρωμοσωμικού προφίλ των αντίστοιχων εμβρύων. Μεγάλης κλίμακας τυχαιοποιημένες μελέτες ελέγχου θα είναι σε θέση να επικυρώσουν αυτήν την πολλά υποσχόμενη μεθοδολογία.Η συγκεκριμένη ερευνητική μελέτη έχει εγκριθεί από την Eπιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης.