MicroRNA analysis reveals putative biomarkers for disease activity and genes in lupus pathogenesis: miR-21 affects PDCD4 expression and regulates aberrant T cell responses

Abstract

Systemic lupus erythematosus (SLE) is the prototypic autoimmune disease that involves multiple genetic and environmental contributions. Although its etiology is not established, it is considered that the immune system of SLE patients is predisposed to aberrant responsiveness. The hallmark of the disease is the production of anti-nuclear autoantibodies and the formation of immunocomplexes that promote injury to various target organs. Defects in T cell antigen receptor–mediated signaling have been shown to lead to breakdown of immunological tolerance. Aberrant co-stimulation and skewed cytokine production by CD4+ T lymphocytes are important mechanisms that lead to B cell hyper-responsiveness in SLE.Considering the complexity of the disease, high throughput techniques have been used to dissect disease mechanisms and identify novel molecules involved in the deregulation of the immune response in human SLE. cDNA microarrays have been used in SLE and have found unique gene signatures in the disease. Although these studies have provided important insights into genetic pathways involved in lupus pathogenesis, they offer only limited information with regard to regulatory mechanisms that control gene expression.Micro-RNAs (miRNAs) are potent negative modulators of genes involved in a variety of cellular processes. In animal cells, miRNAs regulate their targets by translational inhibition and mRNA destabilization. Deregulation of miRNA expression has been implicated in the pathogenesis of several human diseases and they are considered as potential biomarkers and therapeutic targets. Compared with other gene regulatory mechanisms such as epigenetic and transcription factors, miRNA-mediated effects occur prior to protein synthesis, thus allowing for the fine tuning of gene expression. This is particularly important for the immune system that has to adjust rapidly in response to environmental changes.MiRNAs have the potential to regulate the development and function of both the innate and the adaptive immune system and several miRNAs have been shown to be activated after stimulation of various immune pathways. Deregulation of miRNAs leads to uncontrolled immune response and development of autoimmunity in mice. Altered miRNA expression has also been reported in human autoimmune diseases, such as SLE, rheumatoid arthritis and multiple sclerosis but the mechanisms by which these changes promote autoimmunity have not been thoroughly investigated.In this study, we investigated the role of this new class of gene modulators in human SLE. To this end, we analyzed the miRNA profile in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of SLE patients by microarray technology aiming to identify novel genes involved in disease pathogenesis. We found a set of differentially expressed miRNAs in SLE patients compared to healthy individuals and in patients with active versus inactive disease. Several miRNAs displayed a strong correlation with disease activity. Longitudinal studies in large patient cohorts are needed to define the use of miRNAs as disease biomarkers. Importantly, the identified miRNAs are predicted to regulate genes and processes pertinent to the pathogenesis of SLE.Among these genes, mir-21 was one of the highest up-regulated in SLE patients and displayed the strongest correlation with disease activity (r2= 0,92). Compared with controls, CD4 T lymphocytes from patients with SLE had higher basal and activation-induced miR-21 expression. Silencing of miR-21 reversed the activated phenotype of T cells from patients with SLE—namely, enhanced proliferation, IL10 production, CD40L expression and their capacity to drive B cell maturation into Ig-secreting CD19+CD38 hi IgD−plasma cells. Overexpression of miR-21 in normal T cells led to acquisition of an activated phenotype. Investigation of putative gene- targets showed that PDCD4 (a selective protein translation inhibitor) was suppressed by miR-21 and its expression was decreased in active SLE. Together these data suggest that miRNAs may regulate major pathogenic pathways in SLE.

Ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) αποτελεί ένα συστηματικό νόσημα, αυτοάνοσης αιτιολογίας, που περιλαμβάνει πολλαπλές γενετικές και περιβαλλοντικές παραμέτρους. Οι ασθενείς ποικίλουν όσο αναφορά τα κλινικά συμπτώματα, την πρόγνωση και την ανταπόκριση στην θεραπεία. Το κύριο χαρακτηριστικό του νοσήματος είναι η υπερδραστηκότητα των Β λεμφοκυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος και η αυξημένη παραγωγή αυτοαντισωμάτων. Μηχανισμοί που εξαρτώνται αλλά και που είναι ανεξάρτητοι από τα Τ λεμφοκύτταρα θεωρούνται υπεύθυνοι για την υπερδραστηκότητα των Β λεμφοκυττάρων που παρατηρείται στην νόσο. Ο φαινότυπος της νόσου είναι αποτέλεσμα ενός ευρέως φάσματος αλλαγών στην έκφραση γονιδίων που συμβαίνουν όχι μόνο στους προσβεβλημένους ιστούς αλλά και στα δραστικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Λαμβάνοντας υπόψη την πολυπλοκότητα της νόσου, τεχνικές που επιτρέπουν την ταυτόχρονη μελέτη ενός μεγάλου αριθμού παραμέτρων (high throughput techniques) είναι απαραίτητες για την αποσαφήνιση και κατανόηση της αιτιολογίας της νόσου. Η τεχνολογία των μικροσυστοιχείων (microarrays) έχει συμβάλει ουσιαστικά στην ταυτοποίηση μορίων, κυτταρικών πληθυσμών αλλα και σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία της νόσου. Παρόλα αυτά, κρίνεται απαραίτητη η ταυτοποίηση νέων μορίων στόχων με δυνατότητες χρήσης για προγνωστικούς, διαγνωστικούς και θεραπευτικούς σκοπούς στην αντιμετώπιση του ΣΕΛ.Τα microRNAs (miRNAs) αποτελούν μια νέα ομάδα εξελικτικά καλά διατηρημένων μικρών μορίων RΝΑ που δεν κωδικοποιούν για πρωτεΐνες και θεωρούνται σημαντικοί αρνητικοί ρυθμιστές της έκφρασης γονιδίων. Ανάλογα με τον βαθμό συμπληρωματικότητας, τα miRNAs προσδένονται στα mRNAs - στόχους τους και είτε προκαλούν την αποικοδόμηση τους είτε αναστέλλουν την μετάφραση τους σε πρωτεϊνικά μόρια. Σε σύγκριση με άλλες κατηγορίες ρυθμιστών γονιδίων, όπως μεταγραφικούς και επιγενετικούς παράγοντες, τα miRNAs βρίσκονται ένα βήμα ακριβώς πριν την πρωτεϊνική σύνθεση, καθιστώντας τα ,ίσως, πιο κατάλληλα μόρια για την ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης ως αποτέλεσμα ανταπόκρισης του κυττάρου σε εξωτερικά ερεθίσματα και προσαρμογή του στο εξωκυττάριο περιβάλλον. Τα miRNAs εμπλέκονται σε ζωτικής σημασίας διαδικασίες όπως τον πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση και την απόπτωση των κυττάρων και έχουν ήδη συσχετιστεί με πολλές ανθρώπινες ασθένειες. Εξαιτίας της έντονης επιρροής των φλεγμονωδών ερεθισμάτων στην έκφραση γονιδίων, η ανοσιακή απόκριση έχει την δυνατότητα ρύθμισης των επιπέδων έκφρασης διαφόρων miRNAs. Αντίθετα, αρκετά miRNAs έχουν δειχτεί ότι εμπλέκονται στην ρύθμιση του συστήματος της φυσικής και της ειδικής ανοσίας. Μεταβολές στην έκφραση miRNAs έχουν περιγραφεί σε αυτοάνοσα νοσήματα, όπως ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ), η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) και η πολλαπλή σκλήρυνση, αλλά οι μηχανισμοί που διαταράσονται και προάγουν την αυτοανοσία δεν έχουν χαρακτηριστεί. Στην παρούσα μελέτη, θελήσαμε να μελετήσουμε τον ρόλο της νέας αυτής τάξης γονιδίων στην ρύθμιση και διαταραχή της ανοσολογικής απόκρισης στον ΣΕΛ, που θα μπορούσε με την σειρά του να βοηθήσει στην αποσαφήνιση και κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών που εμπλέκονται στη νόσο. Με την χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχείων ταυτοποιήσαμε έναν αριθμό miRNAs με διαφορετική έκφραση στα μονοκύτταρα περιφερικού αίματος ασθενών με ΣΕΛ. Αξίζει να σημειωθεί, ότι, ορισμένα miRNAs είχαν πολύ καλή συσχέτιση με την ενεργότητα της ασθένειας, υποδεικνύοντας ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως προγνωστικοί παράγοντες. Επιπλέον, αρκετά miRNAs προβλέπονται να στοχεύουν γονίδια που εμπλέκονται σε διαδικασίες που είναι διαταραγμένες στον ΣΕΛ. Το mir-21 ήταν απο τα γονίδια που παρουσίαζε αυξημένη έκφραση στα μονοκύτταρα ασθενών με ΣΕΛ, σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες και είχε πολύ καλή συσχέτιση με την ενεργότητα της νόσου (r2= 0,92). Επίσης, η έκφραση του mir-21 βρέθηκε αυξημένη και στα Β αλλά και στα CD4 T λεμφοκύτταρα ασθενών με ΣΕΛ. Σίγηση του miR-21 επηρρέασε σημαντικά χαρακτηριστικά των Τ λεμφοκυττάρων που συμβάλουν στην υπερδραστικότητα τους στον ΣΕΛ, όπως τον πολλαπλασιασμό, την παραγωγή κυτταροκινών (IL10) και την έκφραση μορίων συνδιέγερσης επιφανείας (CD40L). Επιπλέον, η αναστολή της έκφρασης του mir-21 στα CD4 Τ λεμφοκύτταρα μείωσε την ικανότητα τους να προάγουν την διαφοροποίηση των B λεμφοκυττάρων σε Ig-παραγωγά CD19+CD38hiIgD − πλασματοκύτταρα. Αντίθετα, η υπερέκφραση του miR-21 σε υγιή T λεμφοκύτταρα οδήγησε στην ανάκτηση ενός ενεργοποιημένου ‘ΣΕΛ’ φαινοτύπου. Στην συνέχεια, αναζητήσαμε γονίδια-στόχους του miR-21 και βρήκαμε οτι αναστέλει την έκφραση της πρωτεΐνης PDCD4, η οποία βρέθηκε με μειωμένη έκφραση στους ασθενείς με ΣΕΛ. Συνολικά, τα παραπάνω δεδομένα τονίζουν τον ρόλο των miRNAs στην ρύθμιση σημαντικών μοριακών μονοπατιών που συμβάλουν στην παθογένεια της νόσου.