Μελέτη γονίδιων που εκφράζονται στα κοκκώδη κύτταρα της ωοθήκης μετά από πρόκληση ωοθυλακιορρηξίας

Abstract

Aim: The functions of genes expressed in granulosa cells (GCs) of the preovulatory follicle after ovulation induction compared to follicle size have been yet unknown. Materials and methods: After GCs’ culture RNA was isolated by small (follicle diameter <12mm) and large (follicle diameter> 18mm) follicles. Microarray analysis was performed estimating the different gene expression in GCs between large and small follicles. The microarray analysis results were confirmed using quantitative real-time PCR for ADAM28, SPP1, INSIG1, ITGAM, NCAM1, SLC27A6, SOX4, NPY1R and MLLT10. The different SHBG expression between large and small follicles has also been studied using qRT-PCR as well as the correlation of follicle size with the serum and follicular fluid SHBG, E2, T, LH and FSH concentrations. Results: ADAM28 (fold= 3,329, Ρ=0,028), SPP1 (fold=3,084, Ρ=0,044) and ITGAM (fold=4,295, Ρ=0,009) were indeed upregulated in GCs of large follicles included or not [ADAM28 (fold= 2,192, Ρ=0,038), SPP1 (fold=2,899, Ρ=0,037) and ITGAM (fold=2,875, Ρ=0,045)] in microarray analysis. Different INSIG1 expression between large and small follicles was not confirmed. NCAM1 is downregulated (fold=-4,120 P=0,001) in GCs of large follicles included or not [(fold= -1,959, P=0,024)] in microarray analysis. SLC27A6 (fold= -2,294, Ρ= 0,027) is downregulated in GCs of not included large follicles. The different NPY1R, SOX4 and MLLT10 expression between large and small follicles was not confirmed. SHBG gene expression in GCs was not also differed between large and small follicles. Reversely, follicular fluid SHBG levels correlated positively with serum SHBG levels (r=0,411, P<0,001) and with total number of follicles (r=0,202, P<0,02). Serum SHBG levels correlated positively with the total number of follicles (r=0,266, P<0,001). SHBG and testosterone concentrations were higher in small follicles. The concentration of E2 was higher in large follicles but the difference compared to small follicles was not statistically signifigant. The ratio E2/total testosterone was significantly higher in large compared to small follicles (P<0,044). LH and FSH concentrations did not differ between the two groups. Discussion: Τhe assisted reproductive technologies focus on the preovulatory stage as follicles should be fully grown and matured. In this stage many genes may be expressed in granulosa cells. The main functions of these genes are the cell adhesion and intercellular lipid acid transmission.

Σκοπός: Ο ρόλος των γονίδιων, που εκφράζονται στα κοκκώδη κύτταρα (GCs) του προ- ωοθυλακιορρηκτικού ωοθυλάκιου σε σχέση με το μέγεθός του μετά από πρόκληση ωοθυλακιορρηξίας δεν έχει ακόμη αποσαφηνιστεί. Υλικά και μέθοδοι: Μετά από καλλιέργεια των GCs από μικρά (διάμετρος ωοθυλάκιου<12mm) και μεγάλα (διάμετρος ωοθυλάκιου >18 mm) ωοθυλάκια πραγματοποιήθηκε ανάλυση με μικροσυστοιχίες και real-time RT-PCR για τα γονίδια ADAM28, SPP1, ITGAM, INSIG1, NCAM, SLC27A6, SOX4, NPY1R, MLLT10. Μελετήθηκε και η έκφραση του SHBG με real time qRT-PCR. Τέλος, μελετήθηκε η σχέση του μεγέθους του ωοθυλακίου με τις συγκεντρώσεις της SHBG, E2, T, LH και FSH στο ωοθυλακικό υγρό και τον ορό γυναικών Αποτελέσματα: Τα γονίδια ADAM28 (fold= 3,329, Ρ=0,028), SPP1 (fold=3,084, Ρ=0,044) και ITGAM (fold=4,295, Ρ=0,009) υπερεκφράζονται στα GCs μεγάλων ωοθυλακίων, που συμμετείχαν ή όχι [ADAM28 (fold= 2,192, Ρ=0,038), SPP1 (fold=2,899, Ρ=0,037) και ITGAM (fold=2,875, Ρ=0,045)] στην ανάλυση με μικροσυστοιχίες. Η έκφραση του γονιδίου INSIG1 δεν παρουσιάζει στατιστικά σημαντική διαφορά. Το NCAM1 υποεκφράζεται σε GCs μεγάλων ωοθυλακίων, που συμμετείχαν (fold=-4,120 P=0,001) ή όχι (fold= -1,959, P=0,024) στην ανάλυση με μικροσυστοιχίες. Το SLC27A6 (fold= -2,294, Ρ= 0,027) υποεκφράζεται μόνο σε δείγματα, που δε συμμετείχαν στην ανάλυση, ενώ η διαφορετική έκφραση των NPY1R, SOX4 και ΜLLT10 δεν επαληθεύεται. Το γονίδιο SHBG δεν εκφράζεται διαφορετικά σε GCs μικρών και μεγάλων ωοθυλακίων. Αντίθετα, τα επίπεδα της SHBG του ωοθυλακικού υγρού σχετίζονται θετικά με τα επίπεδα της SHBG στον ορό (r=0,411, P<0,001) και με τον ολικό αριθμό των ωοθυλακίων (r=0,202, P<0,02). Τα επίπεδα της SHBG στον ορό σχετίζονται θετικά με τον ολικό αριθμό των ωοθυλακίων (r=0,266, P<0,001). Οι συγκεντρώσεις της SHBG και Τ ήταν υψηλότερες στα μικρά ωοθυλάκια. Η συγκέντρωση της Ε2 ήταν υψηλότερη στα μεγάλα ωοθυλάκια, αλλά η διαφορά σε σχέση με τα μικρά ωοθυλάκια δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Ο λόγος Ε2/ ολική Τ ήταν σημαντικά υψηλότερος στα μεγάλα ωοθυλάκια σε σχέση με τα μικρά ωοθυλάκια (Ρ<0,044). Οι συγκεντρώσεις των γοναδοτροπινών LH και FSH δε διέφεραν ανάμεσα στα μικρά και τα μεγάλα ωοθυλάκια. Συμπεράσματα: Οι τεχνικές υποβοηθούμενης αναπαραγωγής εστιάζουν στο προ-ωοθυλακιορρηκτικό στάδιο, καθώς τα ωοθυλάκια πρέπει να είναι πλήρως ανεπτυγμένα και καλής ποιότητας. Σε αυτό το στάδιο εκφράζονται γονίδια, που πιθανόν εμπλέκονται περισσότερο στην κυτταρική πρόσφυση και τη μεταφορά λιπαρών οξέων στα κύτταρα.