Μελέτη της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων με τη μέθοδο PFA (Platelet Function Assay) σε νεογνά με ενδομήτρια υπολειπόμενη αύξηση

Abstract

INTRODUCTION: The function of human hemostasis is based on the delicate balance between stopping bleeding and avoiding clotting. It consists of 3 main stages: primary hemostasis, secondary hemostasis, and fibrinolysis. Primary hemostasis relies on vasoconstriction and platelet thrombus formation. Platelets, as key players, participate through a series of interrelated processes that include adhesion to the injured endothelium, activation (changes in shape and degranulation), and aggregation into the initially unstable thrombus. These processes are based on the connection of macromolecules such as von Willebrand factor (VWF) and collagen with glycoproteins on platelets’ surface, which lead, through various signaling pathways, to their activation and degranulation. The microenvironment in combination with shear stress in vessels determines the connections that will take part in platelet aggregation.The study of platelet function and primary hemostasis has been based on a series of tests based on platelet aggregation, adhesion with high shear stress conditions (e.g., PFA-100), changes of viscoelastic nature, flow cytometry, and study of degranulation. Each one has distinct advantages and disadvantages. During the last decades, an attempt to apply point-of-care tests (POCTs) has been made, which aims to their widespread use in clinical practice.The PFA-100 method is a rapid, simple, and reproducible test to assess primary hemostasis. It is based on the adhesion, activation, and aggregation of platelets in conditions of high shear stress, representing, in vitro, the processes of primary hemostasis. The evaluation of platelet function is based on the time required to close the hole of a membrane with platelet aggregates. This time is expressed as closure time (CT). Depending on the cartridge, the membrane is covered with either collagen and epinephrine (COL/EPI) or collagen and ADP (COL/ADP). The results are two CTs, the value and combination of which point to various disorders of primary hemostasis.Neonatal hemostatic balance is an evolving process that differs from the one in adults. Regarding primary hemostasis, in vitro platelet hyporeactivity is compensated, in healthy term neonates, effectively by other mechanisms such as high VWF levels, high hematocrit, and should be considered part of a carefully balanced neonatal hemostatic system, rather than a developmental defect. Regarding secondary hemostasis and fibrinolysis, it seems that the reduced levels of coagulation factors are compensated by the reduced levels of natural inhibitors and the reduced fibrinolytic capacity. These adaptive changes are known by the term "Developmental Hemostasis". Whether and how prematurity and various maternal and neonatal diseases disrupt this sensitive system remains a field of interest and research.Intrauterine growth restriction (IUGR) is defined as a fetal growth rate that is less than normal for the growth potential of a particular infant based on the race and sex of the fetus. It is important to distinguish the term “IUGR” from the term “SGA”, whichrefers to infants with a birth weight less than the 10th percentile for that gestational age. IUGR neonates represent 25% of births worldwide, i.e. approximately 30 million newborns per year. Causes of IUGR include maternal, placental, or fetal factors and neonates are divided into two major categories, the symmetric and the asymmetric type. IUGR is associated with both immediate postnatal complications and serious long-term effects. The hematological profile of IUGR neonates is characterized by increased hematocrit, decreased leukocyte and platelet count, but their hemostatic profile has not been studied extensively and in-depth.In recent years, the study of the impact of IUGR on neonatal hemostasis seems to be gaining interest. Thrombocytopenia is a common feature of IUGR neonates through a variety of proposed pathophysiological mechanisms. The studies concerning the platelet function of IUGR neonates are few and do not reach clear conclusions, with some showing hyperreactivity and others hypofunction of platelets in this group of neonates.OBJECTIVE: The present study initially aimed to determine the reference range of CTs in umbilical cord blood samples from healthy appropriate for gestational age (AGA) preterm and term neonates. The main objective was to determine the CTs in umbilical cord blood samples of preterm and full-term IUGR neonates, to compare them with the CTs of AGA neonates, and to correlate them with several perinatal parameters.SUBJECTS AND METHODS: The population of this study consists of 192 newborns, who were born at Aretaieio University Hospital between January 2017 and December 2018. In the group of 118 healthy AGA newborns (control), 104 full-term neonates (with gestational age greater than 37 weeks and normal birth weight for gestational age) and 14 preterm infants (with gestational age less than 37 weeks and normal birth weight for gestational age) were included. The group of 74 IUGR neonates consists of 48 full-term neonates (gestational age greater than 37 weeks, who met criteria for IUGR) and 26 preterm neonates (gestational age less than 37 weeks, who met criteria for IUGR). A detailed family, obstetric, perinatal, and neonatal history was obtained for all participants of the study. In each pregnancy, the cause of IUGR was recorded. Strict exclusion criteria were applied to both groups (AGA and IUGR). All blood samples were obtained from the umbilical vein of a double-clamped umbilical cord by trained personnel and analyzed, without additional processing, via the PFA-100® - Platelet Function Analyzer (DADE BEHRING) within 4 hours of blood collection. For each blood sample, two CTs were recorded in seconds, COL/EPI CT and COL/ADP CT.RESULTS:AGA neonates: Our laboratory’s reference values, in cord blood samples, are for the term AGA neonates COL/EPI CT = 76s - 164s and COL/ADP CT= 59s - 85s. For preterm AGA neonates, COL/EPI CT = 101s - 178s and COL/ADP CT = 64s - 86s. COL/EPI CT is prolonged in preterm AGA neonates (149s) compared to term AGA neonates (111s) (p 0.0236). This finding is consistent with the greater platelet hyporeactivity that accompanies prematurity. There is a negative correlation between COL/ADP CT and gestational age (Spearman’s r = -0.184, p= 0.0475) and COL/ADP CT and platelet count (Spearman’s r = -0.188, p= 0.0437).IUGR neonates: Our study shows that IUGR neonates present prolonged COL/EPI CTs (132s) compared to AGA neonates (112.5s)(p=0.04), while the corresponding difference is not found for COL/ADP CTs. COL/ADP CT is shorter in IUGR neonates delivered via vaginal delivery (p=0.007), in IUGR neonates whose mothers received ampicillin peripartum (p=0.005), and prolonged in IUGR neonates whose mothers received epidural anesthesia (p=0.032). Both COL/EPI CT and COL/ADP CT do not appear to differ according to the cause of IUGR. COL/EPI CT is prolonged in preterm IUGR neonates (137s) compared to full-term IUGR neonates (126s) (p=0.001), while no corresponding difference is observed for COL/ADP CT.CONCLUSIONS: COL/EPI CT is prolonged in both preterm AGA neonates and preterm IUGR neonates, reflecting the platelet dysfunction that accompanies prematurity. As for IUGR neonates, the hyporeactivity of platelets seems to be expressed through prolonged COL/EPI CTs. The increased hematocrit could act as a compensatory mechanism explaining the absence of serious bleeding manifestations. In the group of IUGR neonates, apart from prematurity, we should consider other perinatal parameters in the evaluation of closure times. The PFA-100 method offers the advantage of a quick and simple initial assessment of primary hemostasis and is a useful tool in clinical practice. Umbilical cord blood samples could have a prognostic character among high-risk neonates who require increased surveillance. Our study could help to spread the use of the PFA-100 method in clinical neonatology by contributing to an optimum assessment of hemostasis in IUGR neonates.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η λειτουργία της αιμόστασης στον ανθρώπινο οργανισμό στηρίζεται στη λεπτή ισορροπία ανάμεσα στην αναχαίτιση της αιμορραγίας και την αποφυγή της θρόμβωσης. Aποτελείται από 3 βασικά στάδια: την πρωτογενή αιμόσταση, τη δευτερογενή αιμόσταση και την ινωδόλυση. Η πρωτογενής αιμόσταση στηρίζεται στην αγγειοσύσπαση και τη δημιουργία αιμοπεταλιακού θρόμβου. Τα αιμοπετάλια, ως βασικοί πρωταγωνιστές, συμμετέχουν μέσω μιας σειράς αλληλένδετων διαδικασιών που περιλαμβάνουν την προσκόλληση στο τραυματισμένο ενδοθήλιο, την ενεργοποίηση τους (αλλαγή σχήματος και αποκοκκίωση) και τη συσσώρευση τους στον αρχικό ασταθή θρόμβο. Οι διαδικασίες αυτές στηρίζονται στη σύνδεση μακρομορίων πχ VWF, κολλαγόνο με γλυκοπρωτεΐνες της επιφάνειας τους, που οδηγούν κάθε φορά μέσω ποικίλων σηματοδοτικών μονοπατιών στην ενεργοποίηση και αποκοκκίωση τους. Το μικροπεριβάλλον που σχηματίζεται σε συνδυασμό με τις συνθήκες της διατμητικής τάσης στο αγγείο καθορίζουν τις συνδέσεις που θα οδηγήσουν σε συσσώρευση των αιμοπεταλίων.Η μελέτη της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων και της πρωτογενούς αιμόστασης στηρίζεται τα τελευταία χρόνια σε μια σειρά εξετάσεων που βασίζονται στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων (π.χ. LTA), στην προσκόλληση σε υψηλό στρες διάτμησης (π.χ. PFA-100), στις μεταβολές των ιξωδοελαστικών ιδιοτήτων, σε κυτταρομετρία ροής και έλεγχο αποκοκκίωσης. Κάθε μια έχει ξεχωριστά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα ενώ γίνεται προσπάθεια εφαρμογής point -of-care tests (POCTs) τα τελευταία χρόνια με σκοπό την ευρεία χρήση τους στην κλινική πράξη.Η μέθοδος PFA-100 αποτελεί μια γρήγορη, απλή και αναπαραγώγιμη εξέταση αξιολόγησης της πρωτογενούς αιμόστασης. Βασίζεται στην προσκόλληση, ενεργοποίηση και συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων σε συνθήκες υψηλού στρες διάτμησης αποτυπώνοντας με τον καλύτερο δυνατό τρόπο in vitro τις διαδικασίες της πρωτογενούς αιμόστασης. H αξιολόγηση της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων στηρίζεται στο χρόνο που απαιτείται για να κλείσει η οπή μιας μεμβράνης με συσσωματώματα αιμοπεταλίων. Ο χρόνος αυτός εκφράζεται ως χρόνος κλεισίματος – closure time (CT). Η μεμβράνη, ανάλογα με το φυσίγγιο, καλύπτεται είτε από κολλαγόνο και επινεφρίνη (COL/EPI) είτε από κολλαγόνο και ΑDP(COL/ADP). Προκύπτουν έτσι δύο CTs η τιμή και ο συνδυασμός των οποίων προσανατολίζει σε διάφορες διαταραχές της πρωτογενούς αιμόστασης.Η αιμοστατική ισορροπία στο νεογνικό πληθυσμό είναι διαφορετική από τους ενήλικες και είναι μια εξελισσόμενη διαδικασία. Όσο αφορά στην πρωτογενή αιμόσταση η in vitro υποαντιδραστικότητα των αιμοπεταλίων αντισταθμίζεται στα υγιή τελειόμηνα νεογνά αποτελεσματικά από άλλους μηχανισμούς όπως τα υψηλά επίπεδα VWF, ο υψηλός αιματοκρίτης και MCV και θα πρέπει να εκλαμβάνεται ως μέρος ενός προσεκτικά ισορροπημένου νεογνικού αιμοστατικού συστήματος, αντί για αναπτυξιακή ανεπάρκεια. Όσο αφορά στη δευτερογενή αιμόσταση και την ινωδόλυση φαίνεται πως τα μειωμένα επίπεδα παραγόντων πήξης αντιρροπούνται από τα μειωμένα επίπεδα φυσικών ανασταλτών και τη μειωμένη ινωδολυτική ικανότητα. Οι μεταβολές αυτές προσαρμοστικότητας είναι γνωστές με τον όρο «Αναπτυξιακή Αιμόσταση»- «Developmental Hemostasis». Ενδιαφέρον και πεδίο έρευνας παρουσιάζει το αν και πώς η προωρότητα και οι διάφορες ασθένειες της μητέρας και του νεογνού διαταράσσουν αυτό το ευαίσθητο σύστημα.Ως ενδομήτρια υπολειπόμενη αύξηση (ΕΥΑ) ορίζεται ο ρυθμός εμβρυϊκής ανάπτυξης που είναι μικρότερος από τον κανονικό για το δυναμικό ανάπτυξης ενός συγκεκριμένου βρέφους ανάλογα με τη φυλή και το φύλο του εμβρύου. Είναι σημαντικό να διαχωρίζεται από τον όρο SGA που αναφέρεται σε νεογνά με βάρος γέννησης μικρότερο από το 10ο εκατοστημόριο για τη συγκεκριμένη ηλικία κύησης. Νεογνά με ΕΥΑ αντιπροσωπεύουν το 25% των γεννήσεων, δηλαδή περίπου 30 εκατομμύρια νεογέννητα ετησίως. Οφείλεται σε μητρικούς, πλακουντιακούς ή εμβρυϊκούς παράγοντες και διακρίνεται σε δυο μεγάλες κατηγορίες, το συμμετρικό και τον ασύμμετρο τύπο. Η ΕΥΑ σχετίζεται τόσο με άμεσες μεταγεννητικές επιπλοκές όσο και με σοβαρές μακροχρόνιες επιπτώσεις. Το αιματολογικό προφίλ των νεογνών με ΕΥΑ χαρακτηρίζεται από αύξηση του αιματοκρίτη, μείωση των λευκοκυττάρων και των αιμοπεταλίων χωρίς όμως να έχει μελετηθεί εκτενώς και σε βάθος το αιμοστατικό προφίλ τους.Τα τελευταία χρόνια φαίνεται να κερδίζει ενδιαφέρον η μελέτη της επίπτωσης της ΕΥΑ στη νεογνική αιμόσταση. Η θρομβοπενία αποτελεί κοινό χαρακτηριστικό των νεογνών με ΕΥΑ μέσω ποικίλων προτεινόμενων παθοφυσιολογικών μηχανισμών. Οι μελέτες που αφορούν στον έλεγχο της λειτουργικότητας των αιμοπεταλίων νεογνών με ΕΥΑ είναι λίγες και δεν καταλήγουν σε σαφή συμπεράσματα, με άλλες να παρουσιάζουν υπεραντιδραστικότητα και άλλες υπολειτουργικότητα των αιμοπεταλίων σε αυτή την ομάδα των νεογνών.ΣΚΟΠΟΣ: Η παρούσα μελέτη είχε σκοπό αρχικά να καθοριστεί το εύρος τιμών αναφοράς των CTs σε δείγματα ομφάλιου αίματος από υγιή AGA πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά. Βασικός στόχος ήταν να προσδιοριστούν οι CTs σε δείγματα ομφάλιου αίματος πρόωρων και τελειόμηνων νεογνών με ΕΥΑ, να συγκριθούν με τους αντίστοιχους των AGA νεογνών και να συσχετιστούν με διάφορες περιγεννητικές παραμέτρους.ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ: Το υλικό της διδακτορικής διατριβής αποτελούν 192 νεογνά τα οποία γεννήθηκαν στο Αρεταίειο Νοσοκομείο το διάστημα από τον Ιανουάριο 2017 έως και το Δεκέμβριο 2018. Στην ομάδα των 118 υγιών AGA νεογνών (control) συμπεριελήφθησαν 104 τελειόμηνα νεογνά (με ηλικία κύησης μεγαλύτερη από 37 εβδομάδες και κανονικό βάρος γέννησης για την ηλικία κύησης) και 14 πρόωρα νεογνά (με ηλικία κύησης μικρότερη από 37 εβδομάδες και κανονικό βάρος γέννησης για την ηλικία κύησης). Στην ομάδα των 74 νεογνών με ΕΥΑ συμπεριελήφθησαν 48 τελειόμηνα νεογνά (με ηλικία κύησης μεγαλύτερη ή ίση από 37 εβδομάδες τα οποία πληρούσαν τα κριτήρια χαρακτηρισμού για ΕΥΑ) και 26 πρόωρα νεογνά ( με ηλικία κύησης μικρότερη από 37 εβδομάδες τα οποία πληρούσαν τα κριτήρια χαρακτηρισμού για ΕΥΑ). Σε όλα τα νεογνά της μελέτης ελήφθη λεπτομερές οικογενειακό, μαιευτικό, περιγεννητικό και νεογνικό ιστορικό. Σε κάθε κύηση καταγράφηκε η αιτία της ΕΥΑ. Και στις 2 ομάδες (AGA και EYA) εφαρμόστηκαν αυστηρά κριτήρια αποκλεισμού. Όλα τα δείγματα αίματος ελήφθησαν από την ομφαλική φλέβα διπλά απολινωμένου ομφάλιου λώρου από εκπαιδευμένο προσωπικό και εξετάστηκαν χωρίς πρόσθετη επεξεργασία με τον αναλυτή PFA-100® - Platelet Function Analyzer (DADE BEHRING) μέσα σε 4 ώρες από την αιμοληψία. Για κάθε δείγμα αίματος έγινε καταγραφή δυο CTs σε δευτερόλεπτα, COL/EPI CT και COL/ADP CT.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ:AGA νεογνά: Οι τιμές αναφοράς του εργαστηρίου μας σε δείγματα ομφάλιου αίματος είναι στα τελειόμηνα AGA νεογνά COL/EPI CT 76s - 164s και COL/ADP CT 59s - 85s. Για τα πρόωρα AGA νεογνά είναι COL/EPI CT 101s - 178s και COL/ADP CT 64s - 86s. Ο χρόνος COL/EPI CT είναι παρατεταμένος στα πρόωρα AGA νεογνά (149s) συγκριτικά με τα τελειόμηνα AGA νεογνά (111s) σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (0.0236). Το εύρημα αυτό έρχεται σε συμφωνία με τις εργασίες που υποστηρίζουν τη μεγαλύτερη υποαντιδραστικότητα των αιμοπεταλίων που συνοδεύει την προωρότητα. Υπάρχει αρνητική συσχέτιση μεταξύ του COL/ADP CT και της ηλικίας κύησης (Spearman’s r = -0,184, p= 0.0475) και του COL/ADP CT και του απόλυτου αριθμού αιμοπεταλίων (Spearman’s r = -0,188, p= 0.0437).Νεογνά με ΕΥΑ: Από τη μελέτη μας προκύπτει πως τα νεογνά με ΕΥΑ παρουσιάζουν παρατεταμένους χρόνους COL/EPI CTs (132s) σε σχέση με τα AGA νεογνά (112,5s) (p=0.04), ενώ δε διαπιστώνεται η αντίστοιχη διαφορά για τους COL/ADP CTs. Ο χρόνος COL/ADP CT είναι συντομότερος σε νεογνά με ΕΥΑ που γεννιούνται με φυσιολογικό τοκετό (p=0.007), σε νεογνά με ΕΥΑ που οι μητέρες τους έλαβαν αμπικιλλίνη περί τον τοκετό (p=0.005) και παρατεταμένος σε νεογνά με ΕΥΑ που οι μητέρες τους έλαβαν επισκληρίδιο αναισθησία (p=0.032). Τόσο ο χρόνος COL/EPI CT όσο και ο COL/ADP CT δε φαίνεται να διαφέρουν ανάλογα με την αιτία που προκαλεί την ΕΥΑ. Ο COL/EPI CT είναι παρατεταμένος στα πρόωρα νεογνά με ΕΥΑ (137s) σε σύγκριση με τα τελειόμηνα νεογνά με ΕΥΑ (126s) (p=0.001), ενώ δεν παρατηρείται αντίστοιχη διαφορά για τον COL/ADP CT.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Ο χρόνος COL/EPI CT είναι παρατεταμένος τόσο στα πρόωρα AGA νεογνά όσο και στα πρόωρα νεογνά με ΕΥΑ, αντανακλώντας την υπολειτουργικότητα των αιμοπεταλίων που συνοδεύει την προωρότητα. Όσο αφορά στο σύνολο των νεογνών με ΕΥΑ φαίνεται η υποαντιδραστικότητα των αιμοπεταλίων να εκφράζεται μέσα από τους παρατεταμένους χρόνους COL/EPI CTs. Η αύξηση του αιματοκρίτη θα μπορούσε να δρα αντισταθμιστικά στην απουσία εκδήλωσης σοβαρών αιμορραγικών διαταραχών. Στην ομάδα των νεογνών με ΕΥΑ πέρα από την προωρότητα, θα πρέπει να λαμβάνουμε υπόψιν και άλλες περιγεννητικές παραμέτρους στην αξιολόγηση των χρόνων CTs. Η μέθοδος PFA-100 προσφέρει τη δυνατότητα γρήγορης και απλής αρχικής αξιολόγησης της πρωτογενούς αιμόστασης και αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο στην καθημερινή κλινική πράξη. Τα δείγματα αίματος ομφάλιου λώρου μπορούν να έχουν έναν προγνωστικό χαρακτήρα θέτοντας σε αυξημένη επιτήρηση νεογνά υψηλού κινδύνου. Η μελέτη μας θα μπορούσε να βοηθήσει στην ευρύτερη χρήση της μεθόδου PFA-100 στην κλινική νεογνολογία συμβάλλοντας στην καλύτερη εκτίμηση της αιμόστασης στα νεογνά με ΕΥΑ.