Μελέτη των μοριακών διαταραχών του επιγενετικού μηχανισμού ρύθμισης των κυττάρων στην παθογένεια των μυελοϋπερπλαστικών νεοπλασιών

Abstract

(CNL) and 8/10 (80.00%) in Systemic Mastocytosis (SM). in total 217 out of all MPN patients studied (81.58%), carried at least on driver mutation, whereas only 24 (9.02%) carried modifier mutations, while 44 (16.54%) carried both. However, MF presented the most complicated molecular profile since 42.70% of the respective cases harbored both types of molecular lessions (n=38/89). Non of the genes studied were identified mutated in Chronic Myelogenous Leukemia (CML) patients studied (n=0/29).ii.The same techniques and gene sets were tested for mutations within the 110 patients comprising the MDS/MPN cohort. In total, 91 (82.73%) bearred at least one mutation. The subcohorts were found mutated as follows, 70.18% in CMML (n=40/57), 94.87% in aCML (n=37/39) and 100.00% in MDS/MPN-RS-T (n=14/14). In total, only 15 cases (13.64%) with driver mutations were identified, whereas 69.09% (n=76/110) of MDS/MPN cases presented with at least one modifier mutation. Finally, 11.82% (n=13/110) of MDS/MPN patients studied carried both types of mutations.iii.We designed a custom targeted NGS panel, along with a custom bioinfomratics pipeline, for the interpretation of multiple genomic loci across 26 different genes, of 25 patients. All of them have had their molecular profile checked before, with the utilization of PCR, HRMA and Sanger sequencing. 12 of them were previously found to be bearring at least one mutation, whereas 13 of them had no lessions, whatsoever, according to the afforementioned techniques. The first cohort represented the test group, in order to check the sensitivity and specificity of our NGS protocol. In all 13 patients, those mutations already known were identified during the interpretation of the results, while additional mutations were found in 5 of them. Mutations were spotted in 7 out of the 12 patients without previously undetermined molecular profile.iv.LINEs (Long interspersed nucleotide elements) and SINEs (Short interspersed nucleotide elements), altogether comprise 40-50% of the human genome. Study of methylation of LINE-1 elements is commonly used for the estimation of global DNA methylation levels. The methylation profile of MF and MDS/MPN patients was analyzed for deviations from the respecive levels of normal population. The relative methylation percentage of 15 cases of MDS/MPN and 15 cases of MF, compared to 6 people with normal phenotype and genotype was determined with the utilization of methylation specific HRMA (MS-HRMA). The results were further confirmed with methylation specific pyrosequencing (MSP). 8 patients with MDS/MPN, 28 with MF and 7 people of the general population were tested by using MSP. Data from both techniques coincide. MDS/MPN patients present statistically significant upregulated levels of methylation, whereas the methylation profile of MF patients and normal population is the same.v.Finally, in order to better understand the biology of MF, we performed RNA-Seq in 6 patients presenting with MF and compared their transcription levels with 2 people with normal phenotype and genotype. The bioinformatics pipeline for the analysis of RNA-Seq data is custom and was designed during this study. Statistical analysis identified 2010 genes differentially expressed in MF. Of these 695 were down-regulated, whereas 1315 were up-regulated. The later, correspond to genes related to defence mechanisms against bacterial infections, implicating granulocytes as the main mechanism of action. The down-regulatied genes, on the other hand, imply lymphocyte deactivation, still the mechanism implicated cannot be deciphered by this technique alone and needs to be further studied.

Οι Μυελοϋπερπλαστικές Νεοπλασίες (ΜΥΝ) είναι κλωνικές διαταραχές του αρχέγονου αιμοποιητικού κυττάρου, που χαρακτηρίζονται από άμετρο και άσκοπο κλωνικό πολλαπλασιασμό ενός ή περισσότερων προγονικών κυττάρων της μυελικής σειράς, τα οποία, ωστόσο, διατηρούν σχετικά φυσιολογική ωρίμανση. Ο πολλαπλασιασμός αυτός οδηγεί σε αυξημένο αριθμό κοκκιοκυττάρων, ερυθροκυττάρων ή αιμοπεταλίων στο περιφερικό αίμα.Αντίστοιχα, τα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα/Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα (ΜΔΣ/ΜΥΝ), εκτός από αύξηση του αριθμού των κυττάρων μιας ή περισσότερων σειρών, εμφανίζουν ταυτόχρονα και δυσπλασία του μυελού.Μέχρι πρόσφατα, η διάγνωση και πρόγνωση των υποκατηγοριών αυτών των νοσημάτων, βασιζόταν σχεδόν αποκλειστικά σε κυτταρολογικά χαρακτηριστικά και καρυοτυπικές αναλύσεις, με εξαίρεση πολύ συγκεκριμένες μοριακές βλάβες, όπως εκείνες στα γονίδια JAK2 και MPL, που ανιχνεύονται στην πλειοψηφία των ασθενών με ΜΥΝ, σπάνια δε στα ΜΔΣ/ΜΥΝ.Η πρόοδος της τεχνολογίας οδήγησε σε καλύτερο χαρακτηρισμό της παθογένειας των μυελικών νεοπλασιών, με την ανάδειξη πληθώρας μεταλλάξεων σε γονιδία με ετερογενείς κυτταρικές λειτουργίες και μάλιστα με διαφορετική συχνότητα σε κάθε περίπτωση.Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν οι συχνές μεταλλάξεις προσθήκης ή διαγραφής νουκλεοτιδίων στο εξόνιο 9 του γονιδίου CALR, που ανιχνεύονται στην πλειοψηφία των ασθενών με Ιδιοπαθή Θρομβοκυτταραιμία (ΙΘ) ή Μυελοΐνωση (ΜΙ), οι οποίοι ελέγχονται αρνητικοί για μεταλλάξεις JAK2 και MPL.Επιπλέον μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί σε γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση του επιγενετικού μηχανισμού του κυττάρου, στον κυτταρικό κύκλο, στην ωρίμανση του mRNA και σε άλλες σημαντικές διεργασίες. Οι μεταλλάξεις αυτές θεωρείται πως συμβάλλουν στην πρόοδο και εξέλιξη των μυελικών νεοπλασιών, καθεμία σε διαφορετικό βαθμό, που εξαρτάται από την επίπτωση στο τελικό πρωτεϊνικό προϊόν, στους κυτταρικούς μηχανισμούς όπου εμπλέκεται κάθε γονίδιο, καθώς και στον κυτταρικό κλώνο που εμφανίζεται.Ορισμένες μεταλλάξεις είναι κοινές στις διάφορες ετερογενείς κατηγορίες αιμοποιητικών διαταραχών και μάλιστα ανιχνεύονται σε υψηλά ποσοστά, όπως εκείνες στα γονίδια ASXL1 και SRSF2, οι οποίες έχουν σχετιστεί με κακή πρόγνωση νόσου.Ωστόσο, άλλες μεταλλάξεις φαίνεται πως είναι αποκλειστικές συγκεκριμένων νοσημάτων, όπως συμβαίνει με τα γονίδια CSF3R και SETBP1, που συμβάλλουν στη διαφορική διάγνωση των ΧΟΛ και αΧΜΛ, αντίστοιχα. Κατά τα άλλα, τα συγκεκριμένα νοσήματα είναι δύσκολο να διακριθούν μεταξύ τους.Η μελέτη των κυτταρικών μηχανισμών που επηρεάζονται στις διαφορετικές υποκατηγορίες νοσημάτων του αίματος, εξαιτίας των παραπάνω, αλλά και επιπρόσθετων μεταλλάξεων, είναι ιδιαίτερα σημαντική, αφού με τον τρόπο αυτό αποκαλύπτονται σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία διατταράσονται και στα οποία είναι δυνατόν να παρέμβουμε θεραπευτικά.Οι σύγχρονες τεχνολογίες προσδιορισμού της πρωτοδιάταξης των νουκλεϊκών οξέων (Next Generation Sequencing, NGS) έχουν ήδη συμβάλλει προς αυτή την κατεύθυνση, μέσω μελέτης του ανθρώπινου μεταγραφώματος (RNA-seq).Ωστόσο, αρχικός στόχος παραμένει, ο όσο το δυνατόν πληρέστερος χαρακτηρισμός του τοπίου των μοριακών βλαβών που φέρει κάθε ασθενής, ξεχωριστά. Η χαρτογράφηση των μεταλλάξεων μπορεί να γίνει είτε σταδιακά με τη μελέτη μεμονωμένων γενωμικών περιοχών με παλαιότερες, ήδη εγκαθιδρυμένες τεχνικές μοριακής βιολογίας, είτε σε μεγαλύτερη κλίμακα, με την ενσωμάτωση σύγχρονων τεχνικών, όπως η μελέτη ολόκληρου του γονιδιώματος (whole genome sequencing, WGS), μόνον των περιοχών που εκφράζονται (whole exome sequencing, WES), ή με την ταυτόχρονη ανάλυση πολλαπλών γενωμικών θέσεων (targeted sequencing), με τεχνολογία NGS.Για το λόγο αυτό, στην παρούσα εργασία, αναπτύξαμε και συγκρίναμε διαφορετικά πρωτόκολλα για τη μοριακή διερεύνηση γονιδίων τα οποία εμφανίζονται συχνά μεταλλαγμένα σε ασθενείς με ΜΥΝ και ΜΔΣ/ΜΥΝ. Στη συνέχεια προχωρήσαμε σε συγκριτική ανάλυση του μεταγραφώματος των ασθενών με ΜΙ, με άτομα του γενικού πληθυσμού, σε μία προσπάθεια να διερευνήσουμε βαθύτερα το τοπίο αυτής της περίπλοκης νόσου. Τέλος, μελέτησαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης των ασθενών με ΜΙ και ΜΔΣ/ΜΥΝ, με στόχο να αποκαλύψουμε τυχόν αλλαγές στο πρότυπο αυτής, της πολύ σημαντικής τροποποίησης, δεδομένου ότι τα νοσήματα αυτά χαρακτηρίζονται από μεταλλάξεις σε διάφορα γονίδια που επηρεάζουν ποικιλοτρόπως την επιγενετική κατάσταση του κυττάρου.Τα αποτελέσματα συνοψίζονται ως εξής:i.Μελετήθηκαν, μέσω διερεύνησης μεμονωμένων γενωμικών περιοχών, 266 ασθενείς με ΜΥΝ τόσο για μεταλλάξεις σε κύρια γονίδια της αιμοποίησης, JAK2 (εξόνια 12 και 14), MPL (εξόνιο 10) και CALR (εξόνιο 9), όσο και για μεταλλάξεις σε γονίδια με τροποποιητική δράση, συγκεκριμένα στα ASXL1 (εξόνιο 12), DNMT3A (εξόνιο 23), IDH1 (εξόνιο 4), IDH2 (εξόνιο 4), SETBP1 (εξόνιο 4), SF3B1 (εξόνια 14 και 15), SRSF2 (εξόνιο 1), U2AF1 (εξόνια 2 και 6), CSF3R (εξόνιο 14) και KIT (εξόνιο 17). Συνολικά, μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν σε 241 ασθενείς (90.60%). Στις επιμέρους κατηγορίες, τα ποσοστά αυτά ανέρχονται σε 98.41% στην Αληθή Πολυκυτταραιμία (ΑΠ, n=62/63), σε 86.73% στη ΙΘ (n=85/98), σε 89.89% στη ΜΙ (n=80/89), σε 100.00% στη Χρόνια Ουδετεροφιλική Λευχαιμία (ΧΟΛ, n=6/6) και σε 80.00% στη Συστηματική Μαστοκυττάρωση (ΣΜ, n=8/10). Στο σύνολο των περιπτώσεων και σε ποσοστό 81.58% (n=217/266), ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις σε κύρια γονίδια της αιμοποίησης, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό των μεταλλάξεων με τροποποιητική δράση ανέρχεται σε μόλις 9.02% (n=24/266). Σε 16.54% (n=44/266) των ασθενών με ΜΥΝ που μελετήθηκαν ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις και στις δύο αυτές κατηγορίες γενετικών βλαβών, με το μοριακό τοπίο της ΜΙ να χαρακτηρίζεται ιδιαίτερα πολύπλοκο, αφού το αντίστοιχο ποσοστό ανέρχεται σε 42.70% (n=38/89) των περιστατικών. Καμία από τις μεταλλάξεις που μελετήθηκαν στην παρούσια εργασία δεν εμφανίστηκαν σε μία μικρή κοορτή ασθενών (n=0/29) με Χρόνια Μυελογενή Λευχαιμία (ΧΜΛ) που μελετήθηκαν.ii.Για τις ίδιες μεταλλάξεις, με όμοιες μεθοδολογίες, μελετήθηκαν 110 ασθενείς με ΜΔΣ/ΜΥΝ. Συνολικά, μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν σε 91 ασθενείς (82.73%). Στις επιμέρους κατηγορίες, τα ποσοστά αυτά ανέρχονται σε 70.18% στη Χρόνια Μυελομονοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΜΜΛ, n=40/57), σε 94.87% στην άτυπη Χρόνια Μυελογενή Λευχαιμία (αΧΜΛ, n=37/39) και σε 100.00% στα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα/Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα με παρουσία Δακτυλιωτών Σιδηροβλαστών και Θρομβοκυττάρωση (ΜΔΣ/ΜΥΝ-ΔΣ-Θ, n=14/14). Στο σύνολο των περιπτώσεων και σε ποσοστό 13.64% (n=15/110), ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις σε κύρια γονίδια της αιμοποίησης, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό των μεταλλάξεων με τροποποιητική δράση ανέρχεται σε 69.09% (n=76/110), φανερώνοντας το διαφορετικό μοριακό υπόβαθρο των ΜΔΣ/ΜΥΝ, σε σύγκριση με τα ΜΥΝ. Σε 11.82% (n=13/110) των ασθενών με ΜΔΣ/ΜΥΝ που μελετήθηκαν ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις και στις δύο κατηγορίες μοριακών βλαβών.iii.Σε 25 ασθενείς πραγματοποιήθηκε διερεύνηση για μοριακές βλάβες μέσω targeted sequencing, με τεχνολογία NGS και ανάλυση με βιοπληροφορικό αλγόριθμο που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο. Με την τεχνική αυτή μελετήθηκαν ταυτόχρονα, σε μία αντίδραση, 26 γονίδια, τα περισσότερα για παραπάνω από ένα εξώνια, ενώ για ορισμένα γονίδια ο έλεγχος αφορούσε ολόκληρη την κωδικοποιούσα αλληλουχία. Σε 13 περιπτώσεις ασθενών δεν είχαν ανιχνευθεί μεταλλάξεις, μέσω άλλων τεχνικών μοριακής βιολογίας οι οποίες διερευνούν μεμονωμένες γενωμικές περιοχές, όπως αντίδραση πολυμεράσης τελικού σημείου (PCR), ανάλυση της καμπύλης τήξης των προϊόντων της PCR πραγματικού χρόνου (HRMA) και κατά Sanger προσδιορισμό της πρωτοδιάταξης νουκλεϊκών οξέων. Σε αυτή την κατηγορία συμπεριλαμβάνονται 1 ασθενής με ΑΠ, 3 με ΙΘ, 4 με ΠΜΙ, 1 με ΧΜΜΛ, 2 με Οξεία Μυλογενή Λευχαιμία (ΟΜΛ) και 2 με οικογενή διαταραχή αιμοπεταλίων. Σε 12 περιπτώσεις ασθενών είχαν ήδη ανιχνευθεί μεταλλάξεις με τις προαναφερθείσες τεχνικές. Σε αυτή την κατηγορία περιλαμβάνονται 1 περίπτωση με ΑΠ, 1 με ΙΘ, 7 με ΜΙ, 1 με ΣΜ, 1 με ΧΟΛ και 1 με αΧΜΛ. Αυτοί χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου (test group) για προσδιορισμό της ευαισθησίας και της ακρίβειας της μεθόδου. Σε όλες τις περιπτώσεις επιβεβαιώθηκαν οι ήδη γνωστές μεταλλάξεις, που είχαν ανιχνευθεί εκ των προτέρων με άλλες τεχνικές. Μεταλλάξεις επιπρόσθετες αυτών που ήταν ήδη γνωστές ανιχνεύθηκαν σε 5 ασθενείς, ενώ σε 7 περιστατικά τα οποία ήταν χωρίς ευρήματα, φανερώθηκαν μοριακές βλάβες. Τέλος, σε 6 ασθενείς δεν ανιχνεύθηκε καμία γενετική αλλοίωση.iv.Στη συνέχεια μελετήθηκε το πρότυπο της μεθυλίωσης των ρετρομεταθετών στοιχείων LINE-1 (Long interspersed nucleotide elements, LINEs) σε ασθενείς με ΜΙ και με ΜΔΣ/ΜΥΝ. Τα στοιχεία αυτά μαζί με τις μικρότερες εκδοχές τους (Short interspersed nucleotide elements, SINEs), απαρτίζουν περίπου 40-50% του γονιδιώματος. Ανάλυση της κατάστασης μεθυλίωσης των μεταθετών στοιχείων, αποτυπώνει προσεγγιστικά τα επίπεδα αυτής της επιγενετικής τροποποίησης στο σύνολο του γονιδιώματος (estimation of global methylation levels). Με μεθυλοειδική HRMA (MS-HRMA), προσδιορίστηκαν τα επίπεδα μεθυλίωσης των στοιχείων LINE-1 σε 15 ασθενείς με ΜΔΣ/ΜΥΝ και σε 15 ασθενείς με ΜΙ. Ως φυσιολογικά θεωρήθηκαν τα αντίστοιχα επίπεδα από 6 άτομα του γενικού πληθυσμού. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με προσδιορισμό της κατάστασης μεθυλίωσης των στοιχείων LINE-1 μέσω μεθυλοειδικής πυροαλληλούχισης (MSP), σε 8 ασθενείς με ΜΔΣ/ΜΥΝ και σε 28 ασθενείς με ΜΙ, σε σύγκριση με 7 άτομα με φυσιολογική αιμοποίηση. Οι δύο τεχνικές αποκάλυψαν στατιστικά σημαντικές (p-value<0.05), ανιχνεύσιμες διαφορές, στο πρότυπο της μεθυλίωσης των ρετρομεταθετών στοιχείων LINE-1, στους ασθενείς με ΜΔΣ/ΜΥΝ, όχι όμως και στους ασθενείς με ΜΙ.v.Σε μία προσπάθεια να χαρακτηριστεί καλύτερα η βιολογία της ΜΙ, προχωρήσαμε σε συγκριτική ανάλυση του μεταγραφώματος των ασθενών αυτής της κατηγορίας (n=6), με άτομα του γενικού πληθυσμού (n=2), μέσω τεχνολογίας RNA-Seq και με βιοπληροφορικό αλγόριθμο που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο. Συνολικά, αναδείχθηκαν 2010 γονίδια, ως στατιστικώς σημαντικά (FDR<0.05), διαφορικά εκφραζόμενα στη ΜΙ, σε σύγκριση με το γενικό πληθυσμό. Από τα παραπάνω γονίδια, τα 695 εμφανίζουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης, ενώ τα 1315 αυξημένα. Υπερ-εκφραζόμενα εμφανίζονται γονίδια που αφορούν σε μηχανισμούς άμυνας του οργανισμού, συγκεκριμένα σε ενισχυμένη δραστηριότητα των κοκκιοκύτταρων, για την καταπολέμηση βακτηριακών λοιμώξεων. Ωστόσο, υπο-εκφραζόμενα παρατηρούνται γονίδια που σχετίζονται με τη λειτουργία του λεμφικού ιστού.