Metagenomic and metabolomic analysis of the short-term and long-term effects of antibiotic therapy on the intestinal microbiota in growing kittens and their relation to the overall health status of these kittens

Abstract

Antibiotic treatment in early life influences gastrointestinal (GI) microbial composition and function. In humans, the resultant intestinal dysbiosis is associated with an increased risk for certain diseases later in life. The objective of this study was to determine the temporal effects of antibiotic treatment on the GI microbiome and serum and fecal metabolome of young cats. Fecal samples were collected from cats randomly allocated to receive either amoxicillin/clavulanic acid (20 mg/kg q12h) for 20 days (AMC group; 15 cats) or doxycycline (10 mg/kg q24h) for 28 days (DOX group;15 cats) as part of the standard treatment of upper respiratory tract infection. In addition, feces were collected from healthy control cats (CON group;15 cats). All cats were approximately two months of age at enrolment. Samples were collected on days 0 (baseline), 20 or 28 (AMC and DOX, respectively; last day of treatment), 60, 120, and 300. Serum samples were collected on days 0, 20/28, and 300 from all groups. DNA was extracted and sequencing of the 16S rRNA gene and qPCR assays were performed. Untargeted and targeted metabolomic analyses were performed on both serum and fecal samples. Fecal microbial composition was different on the last day of treatment for AMC cats, and 1 month after the end of antibiotic treatment for DOX cats, compared to CON cats. Species richness was significantly greater in DOX cats compared to CON cats on the last day of treatment. Abundance of Enterobacteriales was increased, and that of Erysipelotrichi was decreased in cats of the AMC group on the last day of treatment compared to CON cats. The abundance of the phylum Proteobacteria was increased in cats of the DOX group on days 60 and 120 compared to cats of the CON group. Only minor differences in abundances between the treatment groups and the control group were present on day 300. Seven metabolites differed significantly in antibiotic-treated cats compared to controls on day 20/28, with two differing on day 60, and two on day 120. Alterations in the pattern of serum amino acids, antioxidants, purines, and pyrimidines, as well as fecal bile acids, sterols, and fatty acids, were observed in antibiotic-treated groups that were not observed in control cats. However, the alterations caused by either amoxicillin/clavulanic acid or doxycycline of the fecal and serum metabolome were only temporary and were resolved by 10 months after their withdrawal. Both antibiotics appear to delay the developmental progression of the microbiome, and this effect is more profound during treatment with amoxicillin/clavulanic acid and one month after treatment with doxycycline. Future studies are required to determine if these changes influence microbiome function and whether they have possible effects on disease susceptibility in cats.

Η χορήγηση αντιμικροβιακής αγωγής κατά την νεαρή ηλικία έχει σημαντική επίδραση στην δομή και λειτουργία του μικροβιώματος. Η δυσβίωση που προκαλείται από την χορήγηση αντιβιοτικών κατά την νεαρή ηλικία έχει συνδεθεί με την εμφάνιση παθήσεων στο μέλλον. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η επίδραση των αντιβιοτικών στο γαστρεντερικό μικροβίωμα και στο μεταβόλωμα του ορού του αίματος και των κοπράνων σε νεαρές γάτες. Σε αυτήν την μελέτη συμπεριλήφθηκαν 30 γάτες με σύνδρομο του ανώτερου αναπνευστικού εκ των οποίων οι 15 έλαβαν αμοξικιλλίνη/κλαβουλανικό οξύ (20 mg/kg κάθε 12 ώρες) για 20 ημέρες (ΑΜΟΞ ομάδα) ενώ οι υπόλοιπες 15 γάτες έλαβαν δοξυκυκλίνη (10 mg/kg κάθε 24 ώρες) για 28 ημέρες (ΔΟΞΥ ομάδα). Η κατανομή σε ομάδες έγινε τυχαία. Επιπλέον 15 κλινικά υγιείς γάτες συμπεριλήφθηκαν στις οποίες δεν χορηγήθηκε καμία αγωγή (ομάδα ελέγχου). Κόπρανα συλλέχθηκαν τις ημέρες 0 (πριν την έναρξη της αγωγής), 20 ή 28 (τελευταία ημέρα αντιμικροβιακής αγωγής στις γάτες των ομάδων ΑΜΟΞ και ΔΟΞΥ, αντίστοιχα), ημέρα 60, 120 και 300. DNA απομονώθηκε από τα δείγματα κοπράνων και έγινε μεταγενωμική ανάλυση του μικροβιώματος με 16SrRNA gene sequencing ενώ επιπλέον πραγματοποιήθηκαν και PCR για την ποσοτικοποίηση συγκεκριμένων βακτηρίων. Επίσης στα δείγματα κοπράνων πραγματοποιήθηκε στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν τις ημέρες 0, 20/28, και 300 στα οποία πραγματοποιήθηκε μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση. Η σύσταση του μικροβιώματος διέφερε σημαντικά την τελευταία μέρα της θεραπείας στην ομάδα ΑΜΟΞ και ένα μήνα μετά την διακοπή της θεραπεία στην ομάδα ΔΟΞΥ, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Η ποικιλότητα του μικροβιώματος ήταν στατιστικά μεγαλύτερη την τελευταία ημέρα της θεραπείας στην ΔΟΞΥ ομάδα συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Τα Enterobacteriales ήταν αυξημένα και τα Erysipelotrichi ήταν μειωμένα στην ΑΜΟΞ ομάδα συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου την τελευταία ημέρα της θεραπείας. Τα Proteobacteria ήταν αυξημένα τις ημέρες 60 και 120 στην ΔΟΞΥ ομάδα συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Ελάχιστες διαφορές στα ποσοστά των βακτηριών βρέθηκαν την ημέρα 300 συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Εφτά μεταβολίτες διέφεραν σημαντικά στις ομάδες που πήραν αντιβιοτικά τις ημέρες 20/28, 2 την ημέρα 60 και 2 την ημέρα 120, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Διαφορές στις συγκεντρώσεις των αμινοξέων, αντιοξειδωτικών, πουρίνων, πυριμιδίνων στον ορό του αίματος και των χολικών οξέων, στερολών και λιπαρών οξέων στα κόπρανα βρέθηκαν με το πέρασμα του χρόνου στις ομάδες που έλαβαν αντιβιοτικά συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, οι διαφορές που προκλήθηκαν από τα αντιβιοτικά στο μεταβόλωμα του ορού και των κοπράνων ήταν παροδικές καθώς δεν ανιχνεύθηκαν 10 μήνες μετά την διακοπή τους. Τα δύο αυτά αντιβιοτικά φαίνεται να καθυστερούν την ανάπτυξη και ωρίμανση του μικροβιώματος και αυτή η επίδραση φαίνεται να είναι πιο έντονη κατά την διάρκεια της θεραπείας με αμοξικιλλίνη/κλαβουλανικό και ένα μήνα μετά την διακοπή της θεραπείας με δοξυκυκλίνη. Μελλοντικές μελέτες χρειάζονται που διερευνούν εάν αυτές οι αλλαγές επηρεάζουν την λειτουργία του μικροβιώματος και εάν έχουν επίδραση στην προδιάθεση σε παθήσεις στις γάτες.