Μελέτη και αξιολόγηση της βιοδραστικότητας-τοξικότητας φυτικών εκχυλισμάτων καλλιεργούμενων και αυτοφυών αρωματικών- φαρμακευτικών φυτών

Abstract

The aim of this thesis was to study aqueous extracts of aromatic and medicinal native plants of the Greek flora. The main goal was the evaluation of their toxicity and biological activity in order to be further developed by the food industry and organic farming.The plants studied were dittany (Origanum dictamnus L.), oregano (Origanum vulgare L.), hyssop (Hyssopus officinalis L.), sage (Salvia officinalis L.), lemon balm (Melissa officinalis L.) and saffron (Crocus sativus L.). Aqueous extracts for the toxicity assessment were prepared in beverage form (1g/100mL water at 85 oC) for all the Lamiaceae species and at the same temperature but at 0.01g/100mL for saffron. Toxicity was evaluated using the MICROTOX analyzer which based on the bioluminescence bacterium Vibrio fischeri. Additionally, toxicity was determined on extracts prepared with water in room temperature with or without ultrasound water bath assistance. Then all the above extracts were further extracted with petroleum ether in order to remove the volatile components and the toxicity tests were also conducted on the volatile free aqueous solutions. According to the results, the extraction procedure was found to influence toxicity of the extracts. Volatile components in the extracts found to act in synergism with water soluble substances. Interaction of water soluble and volatile organic compounds was evaluated through the estimation of synergism ratios (SR). Toxicity of plant extracts examined was not correlated to their total phenolic content and antioxidant activity, but it was found to be linked to the interaction of water soluble and volatile organic compounds. The biological activity of aqueous extracts was further screened against the phytopathogenic fungal species Alternaria alternata, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus and the entomopathogenic species Beauveria bassiana. Biological activity was screened on crude aquatic extracts and their aqueous phase (-bpte) after further extraction with petroleum ether. All the Lamiaceae species examined were found to enhance significantly the mycelium growth. All –bpte extracts stimulated conidia production in high percentages more +300% in some cases compared to the control. The differences in biological activity between crude and –bpte extracts for each plant species were attributed through the calculation of correspondent synergism ratios (SR) to the interaction between volatile and water – soluble substances. Qualitative analysis of all plant extracts was conducted using High Performance Liquid Chromatography. Rosmarinic acid, detected as the most abundant phenolic compound in all extracts analyzed and found to correlate (R2: 0.84) with the stimulation effect on spore production of A. alternata. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) was also employed in order to further investigate the bioactivity of plant extracts to A. alternata. Differences of original spectra were assigned mainly to amides of proteins. The second derivative transformation of spectra revealed changes in spectral regions corresponding to absorptions of the major cellular constituents such as cell membrane and proteins. Principal component analysis of the second derivative transformed spectra confirmed that fatty acids of the cell membranes, amides of proteins and polysaccharides of the cell wall had the major contribution to data variation. FTIR band area ratios were found to correlate with fungal mycelium growth.Furthermore, all extracts were examined on aflatoxin production of Aspergillus flavus in CCA (Coconut Cream Agar) medium. The toxin was extracted with TLC method and results showed notable reduction of aflatoxin production caused by some aromatic plants extracts. The effect of the different extracts at molecular level was further analyzed by Real-time PCR on expression of genes Nor-1 and AflR that are involved in aflatoxin biosynthesis pathway. Quantitave determination of aflatoxin reduction due to the treatment by plant extracts was conducted by ELISA method in in-vivo experiments of the same extracts on Pistachia vera. Results underline that aqueous extracts of Greek native medicinal and aromatic plants contain bioactive compounds which can affect gene expression, and Melissa officinalis extract can be used as a strong anti-aflatoxigenic factor by the food industry.

Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη υδατικών εκχυλισμάτων από καλλιεργούμενα και αυτοφυή αρωματικά και φαρμακευτικά φυτά της Ελληνικής χλωρίδας. Ο στόχος ήταν η αξιολόγηση της βιολογικής τους δράσης και της τοξικότητάς τους προκειμένου αυτά να αξιοποιηθούν μελλοντικά από τη Βιομηχανία τροφίμων και τη βιολογική γεωργία.Μελετήθηκαν τα φυτά: δίκταμο (Origanum dictamnus L.), ρίγανη (Origanum vulgare L.), ύσσωπος (Hyssopus officinalis L.), φασκόμηλο (Salvia officinalis L.), μελισσόχορτο (Melissa officinalis L.) και κρόκος (Crocus sativus L.). H παραλαβή των εκχυλισμάτων για την εκτίμηση της τοξικότητάς τους προσομοιάστηκε με τη συνήθη χρήση αυτών ως αφέψημα (θερμοκρασία νερού 85οC και συγκέντρωση 1g/100mL νερού για τα είδη της οικογένειας Lamiaceae και 0.01g/100mL για τον κρόκο). Η εκτίμηση της τοξικότητας έγινε με τον αναλυτή Microtox® η λειτουργία του οποίου βασίζεται στο βακτήριο Vibrio fischeri, το οποίο εκπέμπει φωταύγεια. Πρόσθετα, για τα προαναφερόμενα φυτικά είδη, εκτιμήθηκε η τοξικότητα τους σε εκχυλίσματα τα οποία προέκυψαν από την ίδια αναλογία φυτικής μάζας σε νερό, και στον ίδιο χρόνο εκχύλισης αλλά με διαφοροποίηση της θερμοκρασίας τους νερού αλλά και με υποβοήθηση από λουτρό υπερήχων. Η εκχύλιση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος έγινε προκειμένου να υπάρχει προσομοίωση της χρήσης των αρωματικών βοτάνων ως ενισχυτικά γεύσης σε φαγητά για τα οποία στη συνέχεια δεν ακολουθεί θερμική επεξεργασία, όπως στην περίπτωση της ρίγανης στις σαλάτες. Η τοξικότητα εκτιμήθηκε και σε εκχυλίσματα που παραλήφθηκαν μετά την περεταίρω εκχύλιση όλων των προηγούμενων με πετρελαϊκό αιθέρα μέσω της οποία αφαιρούνται τα μη υδατοδιαλυτά συστατικά που παραλαμβάνονται με τις διαδικασίες εκχύλισης που αναφέρθηκαν πιο πάνω. Τα αποτελέσματα των ελέγχων τοξικότητας υπέδειξαν ότι η μικρή ποσότητα συστατικών του αιθέριου ελαίου η οποία περνά στην υδατική φάση κατά την παραλαβή των υδατικών εκχυλισμάτων αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών της οικογένειας Lamiaceae με διάφορες τεχνικές εκχύλισης, διαφοροποιεί τη βιολογική δράση του εκχυλίσματος. Η διαφοροποίηση στη βιολογική δράση αποτυπώθηκε από το γεγονός ότι τα μη υδατοδιαλυτά συστατικά του αιθερίου ελαίου που εισέρχονται στο εκχύλισμα είτε προωθούν είτε μερικώς παρεμποδίζουν τη βιολογική δράση των υδατοδιαλυτών συστατικών που περιέχονται στα εκχυλίσματα. Διαπιστώθηκε, επίσης, ότι η μεγαλύτερη συνέργεια στην τοξικότητα μεταξύ μη υδατοδιαλυτών και υδατοδιαλυτών συστατικών στα εκχυλίσματα προέκυψε από την εκχύλιση με νερό σε θερμοκρασία 85ο C. H ανάλυση της τοξικότητας των αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών, προσδιόρισε τις μέγιστες συγκεντρώσεις ανά είδος εκχύλισης, πάνω από τις οποίες κάποιο είδος μπορεί να θεωρηθεί τοξικό καθώς και τη συνέργεια στην τοξικότητα μεταξύ των υδατοδιαλυτών συστατικών και των συστατικών του αιθέριου ελαίου που εισέρχονται στο εκχύλισμα για κάθε φυτικό είδος και διαδικασία εκχύλισης. Οι τιμές τοξικότητας δε βρέθηκε να συσχετίζονται με τη συγκέντρωση των ολικών φαινολικών συστατικών και την αντιοξειδωτική ικανότητα των ίδιων εκχυλισμάτων.Ακολούθως μελετήθηκε η βιολογική δράση υδατικών εκχυλισμάτων όλων των προαναφερόμενων αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών, επί των φυτοπαθογόνων μυκήτων Alternaria alternata, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus και του εντομοπαθογόνου μύκητα Beauveria bassiana. Επίσης, μέσω του υπολογισμού δεικτών συνέργειας μελετήθηκε ο ρόλος του μη υδατοδιαλυτού κλάσματος στη δράση του εκάστοτε εκχυλίσματος. Ακολούθησε ποιοτική ανάλυση των υδατικών εκχυλισμάτων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Αναφορικά με τη βιολογική δράση, το φαινόμενο που παρατηρήθηκε κυρίως ήταν η προώθηση της ανάπτυξης του μυκηλίου και της κονιδιογένεσης από συγκεκριμένα εκχυλίσματα, φθάνοντας σε κάποια από αυτά ποσοστό αύξησης έως και 300% σε σχέση με το μάρτυρα. Διαπιστώθηκε δε, ότι η επίδραση των υδατικών εκχυλισμάτων επί της κονιδιογένεσης έχει ισχυρή συσχέτιση (R2: 0.84) με τη συγκέντρωση του ροσμαρινικού οξέος στα εκχυλίσματα που δοκιμάσθηκαν. Η μελέτη των αλλαγών στη δομική-βιοχημική σύσταση των κυττάρων των οργανισμών στόχων υπό την επίδραση των εκχυλισμάτων αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών με χρήση φασματοσκοπίας υπερύθρου FT-IR, αποτέλεσε το αντικείμενο της επόμενης ενότητας στην παρούσα διατριβή. Με βάση τα αποτελέσματα της φασματοσκοπίας υπερύθρου και της χημειομετρίας βρέθηκε ότι όλα τα εκχυλίσματα επηρέασαν σημαντικά τους πολυσακχαρίτες του κυτταρικού τοιχώματος, τα λιπαρά οξέα της κυτταρικής μεμβράνης καθώς και τις πρωτεΐνες σε βαθμό που να διαχωρίζονται ικανοποιητικά όλες οι επεμβάσεις σε σχέση με το μάρτυρα στις περιοχές του φάσματος που αντιστοιχούν στις προαναφερόμενες ομάδες. Πρόσθετα, ένα εξαιρετικά σημαντικό αποτέλεσμα που προέκυψε από την παρούσα διατριβή και αφορά στη μελέτη μικροοργανισμών με φασματοσκοπία IR, είναι ότι διαπιστώθηκε και καταγράφηκε για πρώτη φορά η πολύ ισχυρή συσχέτιση (R2: 0,88-0,98) της αύξησης του μυκηλίου με το λόγο του εμβαδού συγκεκριμένων κορυφών του φάσματος των μυκήτων. Το γεγονός αυτό, ανοίγει νέους δρόμους στη χρήση της φασματοσκοπίας υπερύθρου και σε μικροβιολογικές εφαρμογές. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η επίδρασης των ανωτέρω εκχυλισμάτων στη βιοσύνθεση αφλατοξίνης από τον Aspergillus flavus. Ο έλεγχος για την παραγωγή αφλατοξίνης πραγματοποιήθηκε σε in vitro και in vivo βιοδοκιμές με ποιοτική ανίχνευση των αφλατοξινών με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, αλλά και με ποσοτική τους εκτίμηση με τη μέθοδο ELISA. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε ο μηχανισμός της επίδρασης των εκχυλισμάτων με μοριακές μεθόδους (Real-time PCR) όπου και διαπιστώθηκε η επίδραση των υδατικών εκχυλισμάτων στην έκφραση του μεταφραστικού παράγοντα AflR αλλά και του γονιδίου Nor-1 που ρυθμίζουν τη βιοσύνθεση αφλατοξίνης από τον A. flavus. Από τα αποτελέσματα συμπεραίνεται ότι στα υδατικά εκχυλίσματα των αυτοφυών και καλλιεργούμενων αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών που εξετάσθηκαν περιέχονται βιοδραστικά μόρια ικανά να παρεμβαίνουν σε επίπεδο έκφρασης γονιδίων. Επιπλέον, με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, το υδατικό εκχύλισμα του μελισσόχορτου (Melissa officinalis) έδειξε με βάση τις in vitro και in vivo βιοδοκιμές ότι μπορεί να αποτελέσει ισχυρό αντιαφλατοξικογόνο παράγοντα ο οποίος μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε τρόφιμα.