Μελέτη της αντικαρκινικής δράσης των διμεταλλικών νανοσωματιδίων

Abstract

Υλικά-Μέθοδοι: Ιn vitro μελέτη: Τρεις διαφορετικές αναλογίες κράματατος (αναλογίες Ag/Au 3:1, 1:1, 1:3) δοκιμάστηκαν (εύρος συγκεντρώσεων 5-50μg/mL) σε φυσιολογικά κύτταρα (HEK293) και καρκινικά (HCT116, HUH7, 4T1) σε δισδιάστατη κυτταροκαλλιέργεια καθώς και σε 3D καλλιέργειες (HCT116) και η κυτταροτοξικότητα υπολογίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε μελέτη έκφρασης σχετιζόμενων με την απόπτωση γονιδίων (P53, BAX, BCL-2,CASP-3) με τη χρήση της RealTime PCR. Παράλληλα, προκειμένου να εκτιμηθεί η αντιμεταστατική δράση τους πραγματοποιήθηκε μελέτη επούλωσης εκδοράς (wound closure assay). In vivo μελέτη: το κράμα με σύσταση AgAu 3:1 ραδιοσημάνθηκε με 68Ga και μελετήθηκε η βιοκατανομή του σε υγιή ποντίκια (Swiss) και σε ποντίκια τύπου (SCID) που έφεραν όγκους από 4Τ1 κύτταρα. Στη συνέχεια τα ποντίκια SCID χωρίστηκαν σε μια ομάδα ελέγχου (χορήγηση φυσιολογικού ορού) και σε 3 ομάδες παρέμβασης (χορηγούμενες συγκεντρώσεις 0,4, 4 και 5,6mg/mL) και από τη στιγμή που ο όγκος απέκτησε διαστάσεις 300mm3 και για 12 ημέρες τα ποντίκια παρακολουθούνταν. Τις ημέρες 1, 3 και 5 οι ομάδες παρέμβασης έλαβαν θεραπεία (ή φυσιολογικό ορό στην ομάδα ελέγχου) και οι διαστάσει του όγκου καταμετρούνταν μέχρι τη 12 ημέρα με παχύμετρο. Ακολούθησε ιστολογική μελέτη των όγκων, του ήπατος και των πνευμόνων καθώς και απεικόνιση με κατάλληλο αντιδραστήριο (silver enhancer) προκειμένου να διερευνηθεί η ύπαρξη τυχόν μεταστατικών εστιών και ηπατικής φλεγμονής). Τέλος, απομονώθηκε RNΑ για την μελέτη της έκφραση της κασπάσης-3 μέσω Real Time PCR και απομόνωση πρωτεϊνών για τη μελέτη των επιπέδων της πρωτεΐνης TRAIL μέσω στυπώματος κατά Western.Υλικά-Μέθοδοι: Ιn vitro μελέτη: Τρεις διαφορετικές αναλογίες κράματατος (αναλογίες Ag/Au 3:1, 1:1, 1:3) δοκιμάστηκαν (εύρος συγκεντρώσεων 5-50μg/mL) σε φυσιολογικά κύτταρα (HEK293) και καρκινικά (HCT116, HUH7, 4T1) σε δισδιάστατη κυτταροκαλλιέργεια καθώς και σε 3D καλλιέργειες (HCT116) και η κυτταροτοξικότητα υπολογίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε μελέτη έκφρασης σχετιζόμενων με την απόπτωση γονιδίων (P53, BAX, BCL-2,CASP-3) με τη χρήση της RealTime PCR. Παράλληλα, προκειμένου να εκτιμηθεί η αντιμεταστατική δράση τους πραγματοποιήθηκε μελέτη επούλωσης εκδοράς (wound closure assay). In vivo μελέτη: το κράμα με σύσταση AgAu 3:1 ραδιοσημάνθηκε με 68Ga και μελετήθηκε η βιοκατανομή του σε υγιή ποντίκια (Swiss) και σε ποντίκια τύπου (SCID) που έφεραν όγκους από 4Τ1 κύτταρα. Στη συνέχεια τα ποντίκια SCID χωρίστηκαν σε μια ομάδα ελέγχου (χορήγηση φυσιολογικού ορού) και σε 3 ομάδες παρέμβασης (χορηγούμενες συγκεντρώσεις 0,4, 4 και 5,6mg/mL) και από τη στιγμή που ο όγκος απέκτησε διαστάσεις 300mm3 και για 12 ημέρες τα ποντίκια παρακολουθούνταν. Τις ημέρες 1, 3 και 5 οι ομάδες παρέμβασης έλαβαν θεραπεία (ή φυσιολογικό ορό στην ομάδα ελέγχου) και οι διαστάσει του όγκου καταμετρούνταν μέχρι τη 12 ημέρα με παχύμετρο. Ακολούθησε ιστολογική μελέτη των όγκων, του ήπατος και των πνευμόνων καθώς και απεικόνιση με κατάλληλο αντιδραστήριο (silver enhancer) προκειμένου να διερευνηθεί η ύπαρξη τυχόν μεταστατικών εστιών και ηπατικής φλεγμονής). Τέλος, απομονώθηκε RNΑ για την μελέτη της έκφραση της κασπάσης-3 μέσω Real Time PCR και απομόνωση πρωτεϊνών για τη μελέτη των επιπέδων της πρωτεΐνης TRAIL μέσω στυπώματος κατά Western.

Στόχοι: Τα διμεταλλικά νανοσωματίδια ΑgAu διαθέτουν ένα σύνολο ελκυστικών ηλεκτρονικών, χημικών, βιολογικών, μηχανικών και θερμικών ιδιοτήτων λόγω της συνεργιστικής δράσης του χρυσού και του αργύρου. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η αξιολόγηση αυτού του κράματος ως προς την αντικαρκινική τους επάρκεια. Αρχικός στόχος είναι η εύρεση της ιδανικής αναλογίας Ag και Au στο διμεταλλικό κράμα με την μέγιστη δυνατή αντικαρκινική δράση και τη μικρότερη δυνατή τοξική στα φυσιολογικά κύτταρα. Κατόπιν, ακολούθησε μελέτη κρίσιμων κλινικών χαρακτηριστικών όπως η βιοκατανομή, η επίδρασή τους στο μέγεθος του όγκου καθώς και η επίδρασή τους στη δημιουργία μεταστάσεων.Υλικά-Μέθοδοι: Ιn vitro μελέτη: Τρεις διαφορετικές αναλογίες κράματατος (αναλογίες Ag/Au 3:1, 1:1, 1:3) δοκιμάστηκαν (εύρος συγκεντρώσεων 5-50μg/mL) σε φυσιολογικά κύτταρα (HEK293) και καρκινικά (HCT116, HUH7, 4T1) σε δισδιάστατη κυτταροκαλλιέργεια καθώς και σε 3D καλλιέργειες (HCT116) και η κυτταροτοξικότητα υπολογίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε μελέτη έκφρασης σχετιζόμενων με την απόπτωση γονιδίων (P53, BAX, BCL-2,CASP-3) με τη χρήση της RealTime PCR. Παράλληλα, προκειμένου να εκτιμηθεί η αντιμεταστατική δράση τους πραγματοποιήθηκε μελέτη επούλωσης εκδοράς (wound closure assay). In vivo μελέτη: το κράμα με σύσταση AgAu 3:1 ραδιοσημάνθηκε με 68Ga και μελετήθηκε η βιοκατανομή του σε υγιή ποντίκια (Swiss) και σε ποντίκια τύπου (SCID) που έφεραν όγκους από 4Τ1 κύτταρα. Στη συνέχεια τα ποντίκια SCID χωρίστηκαν σε μια ομάδα ελέγχου (χορήγηση φυσιολογικού ορού) και σε 3 ομάδες παρέμβασης (χορηγούμενες συγκεντρώσεις 0,4, 4 και 5,6mg/mL) και από τη στιγμή που ο όγκος απέκτησε διαστάσεις 300mm3 και για 12 ημέρες τα ποντίκια παρακολουθούνταν. Τις ημέρες 1, 3 και 5 οι ομάδες παρέμβασης έλαβαν θεραπεία (ή φυσιολογικό ορό στην ομάδα ελέγχου) και οι διαστάσει του όγκου καταμετρούνταν μέχρι τη 12 ημέρα με παχύμετρο. Ακολούθησε ιστολογική μελέτη των όγκων, του ήπατος και των πνευμόνων καθώς και απεικόνιση με κατάλληλο αντιδραστήριο (silver enhancer) προκειμένου να διερευνηθεί η ύπαρξη τυχόν μεταστατικών εστιών και ηπατικής φλεγμονής). Τέλος, απομονώθηκε RNΑ για την μελέτη της έκφραση της κασπάσης-3 μέσω Real Time PCR και απομόνωση πρωτεϊνών για τη μελέτη των επιπέδων της πρωτεΐνης TRAIL μέσω στυπώματος κατά Western.Υλικά-Μέθοδοι: Ιn vitro μελέτη: Τρεις διαφορετικές αναλογίες κράματατος (αναλογίες Ag/Au 3:1, 1:1, 1:3) δοκιμάστηκαν (εύρος συγκεντρώσεων 5-50μg/mL) σε φυσιολογικά κύτταρα (HEK293) και καρκινικά (HCT116, HUH7, 4T1) σε δισδιάστατη κυτταροκαλλιέργεια καθώς και σε 3D καλλιέργειες (HCT116) και η κυτταροτοξικότητα υπολογίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε μελέτη έκφρασης σχετιζόμενων με την απόπτωση γονιδίων (P53, BAX, BCL-2,CASP-3) με τη χρήση της RealTime PCR. Παράλληλα, προκειμένου να εκτιμηθεί η αντιμεταστατική δράση τους πραγματοποιήθηκε μελέτη επούλωσης εκδοράς (wound closure assay). In vivo μελέτη: το κράμα με σύσταση AgAu 3:1 ραδιοσημάνθηκε με 68Ga και μελετήθηκε η βιοκατανομή του σε υγιή ποντίκια (Swiss) και σε ποντίκια τύπου (SCID) που έφεραν όγκους από 4Τ1 κύτταρα. Στη συνέχεια τα ποντίκια SCID χωρίστηκαν σε μια ομάδα ελέγχου (χορήγηση φυσιολογικού ορού) και σε 3 ομάδες παρέμβασης (χορηγούμενες συγκεντρώσεις 0,4, 4 και 5,6mg/mL) και από τη στιγμή που ο όγκος απέκτησε διαστάσεις 300mm3 και για 12 ημέρες τα ποντίκια παρακολουθούνταν. Τις ημέρες 1, 3 και 5 οι ομάδες παρέμβασης έλαβαν θεραπεία (ή φυσιολογικό ορό στην ομάδα ελέγχου) και οι διαστάσει του όγκου καταμετρούνταν μέχρι τη 12 ημέρα με παχύμετρο. Ακολούθησε ιστολογική μελέτη των όγκων, του ήπατος και των πνευμόνων καθώς και απεικόνιση με κατάλληλο αντιδραστήριο (silver enhancer) προκειμένου να διερευνηθεί η ύπαρξη τυχόν μεταστατικών εστιών και ηπατικής φλεγμονής). Τέλος, απομονώθηκε RNΑ για την μελέτη της έκφραση της κασπάσης-3 μέσω Real Time PCR και απομόνωση πρωτεϊνών για τη μελέτη των επιπέδων της πρωτεΐνης TRAIL μέσω στυπώματος κατά Western.