Ιn vitro διερεύνηση της ικανότητας στόχευσης του αιματεγκεφαλικού φραγμού και της αντικαρκινικής δράσης στοχευμένων πολυλειτουργικών μαγνητολιποσωμάτων που εγκλωβίζουν δοξορουβικίνη

Abstract

Magnetoliposomes can provide platforms for simultaneously carrying therapeutics and diagnostics. The controlled optical properties of the magnetic nanoparticles combined with the versatility of liposomes as carriers can potentially enhance the efficacy of treatment for selective drug delivery by means of an external magnetically guided deposition and prolonged targeting by receptor-mediated activation (e.g., pegylation and surface modification: ligands and antibodies). Due to their optical properties, magnetic nanoparticles can serve as MRI contrast agents allowing their in vivo monitoring and distribution of the pharmaceuticals in a non-invasive way.The aim of this work was initially the formulation of magnetoliposomes, their physicochemical characterization and the impact of various factors on their physicochemical properties and stability.For the preparation of the MLs the initial target was the entrapment of the maximum concentration of USPIOs in small unilamellar vesicles, while retaining their size (<200nm) in order to exploit the effect of enhanced permeability and retention (EPR effect) presented by cancer cells. The DRV method (extruded), provided MLs with greater entrapment at the desired size. The addition of cholesterol to the ML had no significant effect on encapsulation, which applied also to the addition of negative charge (PG lipid), while addition of lipid PEG and higher initial ratios USPIOs / lipid increased the entrapment. Encapsulation of the USPIOs into liposomes led in a sharp increase of the magnetic response while higher Fe/Lipid ratio increased it even further. The same applied when 4mol% lipid-PEG was added or MLs size was increased, whereas addition of cholesterol reduced the response to the external magnetic field. USPIOs encapsulation also increased their ability as contrast agents, regardless lipid composition, addition of lipid PEG did not bring about any drastic change, while higher Fe/Lipid ratio led to an increase. MLs were stable long enough for use in in vivo applications and exhibited almost no cytotoxicity. Finally MLs were studied in vitro for their ability to cross the where it was found that in the presence of magnetic field, permeation increases up to 10 times, revealing the possibility offered by MLs to deliver drugs to the brain utilizing magnetic targeting.Next aim of this work was the formation of t-MLs for targeting the BBB. MLs decorated with either OX-26 antibody (targeting of the transferrin receptor) or the ApoE peptide (lipoprotein receptor targeting) or both were prepared and their effect on the physicochemical properties of MLs was studied. Decoration with one ligand had no significant effect on the entrapment or MLs’ size whilst a combination of 2 or 3 ligands lead to a slight decrease in the entrapment. Addition of an antibody on the MLs surface caused a slight reduction of the magnetophoretic ability of the MLs while this was the case also for their contrast agent ability. t-MLs were found to be stable for time sufficient enough for their administration and showed no cytotoxicity. In regards to their ability to cross the BBB, in vitro decoration with one ligand increased permeation of ML at least 5 times while decoration with two ligands had a cumulative effect, enhancing BBB permeation more than 10 times. These results demonstrate the ability of t-ML to target the BBB and their possible use as a diagnostic imaging tool of the brain.After the successful preparation of MLs and t-MLs that can be used for diagnosis, the next step was the preparation of MLs which combine their diagnostic capability with a therapeutic effect. To this end we investigated the preparation of MLs co-encapsulation USPIOs with doxorubicin, a molecule with anti-cancer activity. For the co-encapsulation of doxorubicin and USPIOs a combination of the DRV technique and active loading was utilized. The presence of USPIOs, the DOX / lipid ratio and the DOX / USPIOs ratio had almost no effect on doxorubicin encapsulation as neither had the decoration of MLs with an antibody. USPIOs-DOX co-encapsulation had no effect on the retention of doxorubicin and it’s release rate nor on the retention of USPIOs while MF-ML remained stable in the presence of serum proteins for sufficient time. Then the MF-ML prepared were studied in vitro for their antitumor activity in which the results showed that USPIOs co-encapsulation does not affect the antitumor activity of doxorubicin which is dose-dependent, the effect of magnetic field is Fe concentration-dependent, while dual targeting (passive via the magnetic field and active through the antibody) exhibited the highest antitumor activity.

Τα μαγνητικά λιποσώματα μπορούν να αποτελέσουν την κατάλληλη πλατφόρμα για την ταυτόχρονη στοχευμένη μεταφορά/χορήγηση θεραπευτικών και διαγνωστικών ενώσεων. Οι ελεγχόμενες οπτικές ιδιότητες των μαγνητικών νανοσωματιδίων σε συνδυασμό με την ευελιξία των λιποσωμάτων ως φορέων μπορεί δυνητικά να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της αγωγής με την επιλεκτική μεταφορά φαρμάκων μέσω μαγνητικά καθοδηγούμενης εναπόθεσης και ταυτόχρονης στόχευσης με ενεργοποίηση μέσω υποδοχέα (π.χ., πεγκυλίωση και επιφανειακή τροποποίηση : προσδέτες και αντισώματα). Λόγω των οπτικών ιδιοτήτων τους, τα μαγνητικά νανοσωματίδια μπορούν να χρησιμεύσουν και ως σκιαγραφικές ουσίες κατά την μαγνητική απεικόνιση (MRI), επιτρέποντας την in vivo παρακολούθηση και μεταφορά των φαρμάκων με μη επεμβατικό τρόπο. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν αρχικά η παρασκευή μαγνητολιποσωμάτων, ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός τους καθώς και η μελέτη επίδρασης διαφόρων παραγόντων στις φυσικοχημικές ιδιότητες και την σταθερότητά τους. Κατά την παρασκευή των ΜΛ αρχικός στόχος ήταν ο εγκλωβισμός της μέγιστης δυνατής συγκέντρωσης USPIOs σε μονοστοιβαδιακά λιποσώματα μικρού μεγέθους (<200nm) για να μπορούν να εκμεταλλευθούν το φαινόμενο αυξημένης διαπερατότητας και συγκράτησης (EPR effect) των καρκινικών κυττάρων. Η μέθοδος DRV(extruded) παρείχε μαγνητολιποσώματα με τον μεγαλύτερο εγκλωβισμό και στο επιθυμητό μέγεθος. Η προσθήκη χοληστερόλης ή φορτίου (PG) στα ΜΛ δεν είχε κάποια σημαντική επίδραση στον εγκλωβισμό, ενώ η προσθήκη λιπιδικού PEG καθώς και η αύξηση της αρχικής αναλογίας USPIOs/λιπίδιο οδήγησε σε αύξηση του εγκλωβισμού. Ο εγκλωβισμός των USPIOs σε λιποσώματα αύξησε κατακόρυφα την μαγνητική τους απόκριση ενώ η αύξηση της αναλογίας Fe/Λιπιδίου, η αύξηση του μεγέθους των ΜΛ και η προσθήκη 4 mol% λιπιδικού-PEG οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση. Αντιθέτως η προσθήκη χοληστερόλης προκάλεσε μείωση. Ο εγκλωβισμός των USPIOs αύξησε επίσης την σκιαγραφική τους ικανότητα ανεξαρτήτου λιπιδικής σύστασης, η προσθήκη λιπιδικού PEG δεν επέφερε κάποια δραστική μεταβολή ενώ η αύξηση της αναλογίας Fe/Λιπιδίου οδήγησε σε αύξηση. Τα ΜΛ που παρασκευάστηκαν παρέμειναν σταθερά για διάστημα αρκετό για την χρήση τους σε in vivo εφαρμογές ενώ επέδειξαν σχεδόν μηδενική κυτταροτοξικότητα. Τέλος τα ΜΛ μελετήθηκαν in vitro ως προς την ικανότητά τους να διαπερνούν τον ΑΕΦ όπου διαπιστώθηκε ότι παρουσία μαγνητικού πεδίου η διαπέραση αυξάνει έως και 10 φορές φανερώνοντας την δυνατότητα που παρέχουν τα ΜΛ για την μεταφορά φαρμάκων στον εγκέφαλο μέσω μαγνητικής στόχευσης. Επόμενος σκοπός της εργασίας αυτής ήταν ο σχηματισμός ΜΛ-Σ για την στόχευση του ΑΕΦ. Έτσι παρασκευάστηκαν ΜΛ που έφεραν στην επιφάνεια τους είτε αντίσωμα ΟΧ-26 (στόχευση του υποδοχέα της τρανσφερίνης), είτε το πεπτίδιο ApoE (στόχευση υποδοχέα λιποπρωτεϊνης) είτε και τα δύο μαζί. Η προσθήκη ενός προσδέτη στην επιφάνεια δεν είχε σημαντική επίδραση στον εγκλωβισμό και το μέγεθος των ΜΛ-Σ ενώ ο συνδυασμός 2 και 3 προσδετών επέφερε μια μικρή μείωση στον εγκλωβισμό. Παρατηρήθηκε επίσης μείωση της μαγνητοφορετικής ικανότητας και της σκιαγραφικής ικανότητας των ΜΛ που παρέμειναν όμως αρκετά υψηλές. Τα ΜΛ-Σ ήταν σταθερά για χρονικό διάστημα αρκετά μεγάλο ενώ επέδειξαν μηδενική κυτταροτοξικότητα. Ως προς την ικανότητα τους να διαπερνούν τον ΑΕΦ invitro, η προσθήκη ενός προσδέτη (ApoE,OX-26) αύξησε την διαπέραση των ΜΛ τουλάχιστον 5 φορές ενώ η προσθήκη και των δύο προσδετών φαίνεται να έχει αθροιστικό αποτέλεσμα, δεκαπλασιάζοντας το ποσοστό διαπέρασης. Τα αποτελέσματα αυτά φανερώνουν την ικανότητα των ΜΛ-Σ να στοχεύσουν τον ΑΕΦ και την πιθανή αξιοποίησή τους ως διαγνωστικό μέσο απεικόνισης του εγκεφάλου.Επόμενο βήμα αποτέλεσε η παρασκευή ΜΛ που θα συνδυάζουν την διαγνωστική ικανότητα με την θεραπευτική. Για τον σκοπό αυτό μελετήθηκε η παρασκευή ΜΛ που συν-εγκλωβίζουν USPIOs και δοξορουβικίνη, ένα μόριο με αντικαρκινική δράση. Για τον συν-εγκλωβισμό δοξορουβικίνης και USPIOs χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός των τεχνικών DRV και ενεργής φόρτωσης. Η παρουσία των USPIOs, η αναλογία ΔΟΞ/Λιπίδιο καθώς και η αναλογία ΔΟΞ/USPIOs δεν είχαν κάποια επίδραση στον εγκλωβισμό της δοξορουβικίνης όπως ούτε η παρουσία αντισώματος. Ο συν-εγκλωβισμός USPIOs-ΔΟΞ δεν είχε κάποια επίδραση στην συγκράτηση της δοξορουβικίνης και στον ρυθμό απελευθέρωσης της αλλά ούτε και στην συγκράτηση των USPIOs ενώ τα ΠΛ-ΜΛ παρέμειναν σταθερά παρουσία πρωτεϊνών ορού για αρκετό χρονικό διάστημα ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε invivo εφαρμογές. Τα ΠΛ-ΜΛ μελετήθηκαν invitro ως προς την αντικαρκινική τους δράσης όπου τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συν-εγκλωβισμός USPIOs δεν επιδρά στην αντικαρκινική δράση της δοξορουβικίνης η οποία είναι δοσο-εξαρτώμενη, ότι η επίδραση του μαγνητικού πεδίου είναι εξαρτώμενη από την συγκέντρωση Fe, καθώς και ότι η αντικαρκινική δράση αυξάνεται μέσω διπλής στόχευσης (παθητική μέσω του μαγνητικού πεδίου και ενεργητική μέσω του αντισώματος).