Παρασκευή, μελέτη σταθερότητας και αποτελεσματικότητας (in vitro και in vivo) νανολιποσωμάτων για χορήγηση φαρμάκων στον εγκέφαλο

Abstract

Drug development for the Central Nervous System is seriously hampered by the lack of effective methods for permeation of drugs through the BBB and into the brain. For this reason, research is directed to the use of nanoparticles for the penetration of BBB. The use of targeted nanoparticles is recently upgraded and researchers attempt to resolve the configuration issues and transport across the BBB to develop commercially available products. Various types of nanoparticles are under investigation for transporting drugs across the BBB, whereas studies of such nanoparticles aided the development of cell model of BBB. In this study we used hCMEC/D3 cell line as an in vitro model of BBB to investigate the influence of size and surface charge of nanosized liposomes in their interaction with these cells and to eliminate the possibility of misinterpretation of targeting capacity of larger decorated liposomes during in vitro tests. Liposomes with different average diameters, ideally between 50 and 400nm and a different negative z-potential were evaluated, for their uptake by hCMEC/D3 cells and for their permeability across monolayers of hCMEC/D3 cells. Results showed that the size of liposomes have a significant effect both on the uptake by cells and in their permeability across cell monolayers. This has been verified for uncharged liposomes composed of DSPC and for liposomes with a negative surface charge (which has been replaced 10mole% [the total lipid mole] with DSPG). On the other hand, the effect liposome surface charge in their interaction with the hCMEC/D3 cells were less pronounced (in the range of different surface charge values were evaluated from -2 to -16mV). The replacement of part of DSPC with DSPG, at such a low amount as 5mol% (of total lipid), causes a significant increase in uptake of liposomes by the cells. However any further increase in the uptake of the liposomes was observed when used even higher concentrations of DSPG (up to 15mol%). Moreover, increasing the negative charge of the liposome surface does not significantly affect their transport across the monolayer in the range between -2 and -12.9mV, but it was observed a significant reduction in permeability across cell monolayers in liposomes with larger negative value zeta-potential (-16mV) among those tested. Moreover, permeability valuew of various liposomal formulations across the cell monolayer was calculated, which confirmed the effect of liposome size and charge in the transfer rate from the monolayer.Then, in order to develop targeted liposomes to release imaging agents and/or therapeutic agents against Alzheimer's disease and other related diseases of the CNS, targeted liposomes and dual targeted liposomes were prepared using a monoclonal antibody (OX-26) for the transferrin receptor (known for targeting of the transferrin receptor), and a peptide derivative of apolipoprotein E3 (ApoE) targeting the receptor associated with low density lipoprotein (LPR), for the first time together in the same liposome. To investigate whether the dual-targeted liposomes have enhanced targeting ability of BBB compared to corresponding targeted liposomes in vitro and in vivo studies were performed, in which the targeting ability of the different types of liposomes is compared to non-targeted PEG liposomes. After application of different ligand attachment methodologies in order to achieve optimal ligand immobilization yield and lipid recovery, targeted liposomes were evaluated for their BBB targeting ability to hCMEC/D3 cells and then in vivo, in order to investigate whether the in vitro model of BBB can predict the in vivo behavior of liposomes. After evaluating liposome characteristics (size distribution, z-potential, etc.) and if considered sufficient for in vivo administration, dual targeted liposomes were subjected to in vitro testing to investigate: (i) Their cytotoxicity potential and (ii) Their uptake by hCMEC/D3 cells and their ability to transport through the in vitro model of BBB. In all in vitro studies, results showed significant improvement of brain targeting ability for dual-targeted liposomes (higher cell uptake and higher permeability through the monolayers of hCMEC/D3) compared to liposomes without ligands (simple PEG- liposomes) or with liposomes having only one ligand, which showed satisfactory results (a higher uptake and penetration) compared with PEG-liposomes. Moreover, no liposome form caused no cytotoxicity. Two in vivo live imaging studies of mice (using DiR dye for liposome monitoring) confirmed the brain targeting capacity of dual targeted liposomes. However, additional in vitro studies were performed in which interactions of these liposomes with cells in the presence of increasing concentrations of serum proteins were evaluated, to investigate whether probably a better correlation between in vitro and in vivo results can be produced, in different experimental conditions.The same in vitro and in vivo studies were carried out for liposomes composed of different lipid mixtures, sphingomyelin with PA and decorated with ApoE peptide at different concentrations of ligand in the liposome surface (if considered sufficient in vivo administration) and has shown previously their ability to bind with high affinity to Aβ1-42 peptides. The cellular uptake of nanosized liposomes of sphingomyelin with 2.5mol% ApoE was increased compared with those with 0.05mol% in the presence of serum proteins in 5%, but with increasing concentration of serum proteins to the modified cell model, the cellular uptake of these is decreased in all cases (in the presence of PA and/or PEG), which is not observed in the liposomes of sphingomyelin with ApoE in 0.05mol% density, even in the presence of 50% of serum proteins. In the in vivo study of BBB targeting only sphingomyelin liposomes with 0.05mol% density of the peptide and without the presence of the PA was studied, because of their better behavior in the in vitro tests, having as control samples ApoE-liposomes composed of DSPC lipid. There was no increased targeting ability of BBB, which however probably depends on the ligands density at the surface and the lipid dose administered intravenously.Finally, multifunctional liposomes decorated with a curcumin lipid derivative which is referred as Treg (this derivative has been shown to exhibit very high affinity for Aβ peptides, when immobilized to liposomal surfaces), except to the two ligands for BBB targeting were prepared as a likely diagnosis/treatment system for Alzheimer's disease. Immobilization of ligands to liposome surface was optimized, by evaluating different methodologies and the chosen technique gave the best results in terms of the size of liposomes, the attachment yield of ligands and the lipid recovery. After having established that multifunctional liposomes have sufficient stability and integrity and showed no toxicity, then they tested for their BBB targeting ability (compared with dual-targeted liposomes). Results showed that multifunctional liposomes seem to have similar BBB targeting ability to that of dual targeted liposomes. In vivo studies confirmed the similar behavior of multifunctional liposomes and dual targeted liposomes with respect to their ability to reach the brain, in good correlation with the in vitro studies in the cellular BBB model. Multifunctional liposomes with simple BBB ligand density at their surface have slightly higher fractions of DiR signals to the brain/body compared to the corresponding double density. By increasing the density of BBB targeting ligands in multifunctional liposomes, their ability to target BBB and remain in the brain is reduced, which is likely due to some interactions between Treg and amyloid in the brain, or in the interaction between BBB targeting ligands and Treg molecules (which causes a reduced ability for BBB targeting ligands to interact with cellular receptors in BBB cells).

Η ανάπτυξη φαρμάκων για το ΚΝΣ παρεμποδίζεται σοβαρά από την έλλειψη αποτελεσματικών μεθόδων για την διαπέραση φαρμάκων, διαμέσου του ΑΕΦ και εντός του εγκεφάλου. Για το λόγο αυτό η έρευνα στρέφεται στη χρήση νανοσωματιδίων για τη διαπέραση του ΑΕΦ. Η χρήση των στοχευμένων νανοφορέων έχει πρόσφατα αναβαθμιστεί και γίνεται προσπάθεια να επιλυθούν τα θέματα διαμόρφωσης αλλά και μεταφοράς κατά μήκος του ΑΕΦ ώστε να αναπτυχθούν εμπορικώς διαθέσιμα προϊόντα. Διάφοροι τύποι νανοσωματιδίων είναι υπό μελέτη για τη μεταφορά φαρμάκων διαμέσου του ΑΕΦ, ενώ οι μελέτες ανάπτυξης τέτοιων νανοσωματιδίων υποβοηθούνται με την ανάπτυξη κυτταρικών μοντέλων του ΑΕΦ. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά hCMEC/D3 ως in vitro μοντέλο του ΑΕΦ, για να διερευνηθεί η επίδραση του μεγέθους και του επιφανειακού φορτίου των νανολιποσωμάτων στην αλληλεπίδρασή τους με αυτά τα κύτταρα και να αποκλεισθεί η πιθανότητα εσφαλμένης ερμηνείας της ικανότητας στόχευσης διακοσμημένων λιποσωμάτων με μεγαλύτερο μέγεθος κατά τις in vitro δοκιμές. Αξιολογήθηκαν λιποσώματα με διαφορετικές μέσες διαμέτρους, θεωρητικά μεταξύ 50 και 400 nm και με διαφορετικό αρνητικό ζ-δυναμικό, ως προς την πρόσληψή τους από τα κύτταρα hCMEC/D3, καθώς και ως προς τη διαπερατότητα τους διαμέσου μονοστοιβάδων των hCMEC/D3 κυττάρων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το μέγεθος των λιποσωμάτων έχει σημαντική επίδραση τόσο στην πρόσληψή τους από τα κύτταρα, όσο και στη διαπερατότητα τους κατά μήκος των κυτταρικών μονοστοιβάδων. Αυτό έχει επαληθευτεί για τα μη φορτισμένα λιποσώματα που αποτελούνται από DSPC καθώς και για τα λιποσώματα με αρνητικό φορτίο επιφάνειας (στα οποία έχει γίνει αντικατάσταση του 10mol% [από τα συνολικά mol λιπιδίου] με DSPG). Από την άλλη πλευρά, η επίδραση του επιφανειακού φορτίου των λιποσωμάτων στην αλληλεπίδρασή τους με τα κύτταρα hCMEC/D3 είναι λιγότερο έντονη (στην περιοχή των διαφορετικών τιμών επιφανειακού φορτίου που αξιολογήθηκε που ήταν από -2 έως -16mV). Η αντικατάσταση ενός μέρους του DSPC με DSPG, σε ένα τόσο χαμηλό ποσό όσο το 5mol% (των συνολικών λιπιδίων), προκαλεί μία σημαντική αύξηση στην πρόσληψη λιποσωμάτων από τα κύτταρα. Ωστόσο καμιά περαιτέρω αύξηση της πρόσληψης των λιποσωμάτων δεν παρατηρήθηκε όταν χρησιμοποιήθηκαν ακόμα υψηλότερες συγκεντρώσεις του DSPG (μέχρι 15mol%). Επιπλέον, η αύξηση του αρνητικού φορτίου της επιφάνειας των λιποσωμάτων δεν επηρεάζει σημαντικά την μεταφορά τους διαμέσου της μονοστοιβάδας στην περιοχή μεταξύ -2 και -12.9mV, αλλά παρατηρήθηκε μια σημαντική μείωση στην διαπερατότητα κατά μήκος των κυτταρικών μονοστοιβάδων για τα λιποσώματα με τη μεγαλύτερη τιμή αρνητικού ζ-δυναμικό (-16mV) μεταξύ εκείνων που δοκιμάστηκαν. Επιπλέον, υπολογίστηκε η διαπερατότητα των διαφόρων λιποσωμικών τύπων κατά μήκος της κυτταρικής μονοστοιβάδας, με την οποία επιβεβαιώθηκαν οι επιπτώσεις του μεγέθους και του φορτίου των λιποσωμάτων στο ρυθμό μεταφοράς τους από τη μονοστοιβάδα.Στη συνέχεια, με σκοπό την ανάπτυξη στοχευμένων λιποσωμάτων για την απελευθέρωση παραγόντων απεικόνισης ή/και θεραπευτικών παραγόντων κατά της νόσου Alzheimer και άλλων σχετικών παθολογιών του ΚΝΣ, παρασκευάστηκαν λιποσώματα στόχευσης και λιποσώματα διπλής στόχευσης χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (OX-26) για τον υποδοχέα τρανσφερίνης (γνωστό για τη στόχευση του υποδοχέα τρανσφερίνης) και ένα παράγωγο πεπτιδίου της απολιποπρωτεΐνης Ε3 (ΑροΕ) που στοχεύει στον υποδοχέα που σχετίζεται με τη λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LPR), για πρώτη φορά μαζί στο ίδιο λιπόσωμα. Προκειμένου να διερευνηθεί αν τα λιποσώματα διπλής στόχευσης έχουν αυξημένη ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ σε σύγκριση με τα αντίστοιχα λιποσώματα στόχευσης, διεξήχθησαν in vitro και in vivo μελέτες, στις οποίες συγκρίθηκε η ικανότητα στόχευσης των διαφόρων τύπων λιποσωμάτων με μη-στοχευμένα PEG λιποσώματα. Μετά την εφαρμογή διαφορετικών μεθοδολογιών προσκόλλησης των προσδετών, προκειμένου να επιτευχθεί η βέλτιστη απόδοση ακινητοποίησης του προσδέτη και λιπιδικής ανάκτησης, αξιολογήθηκαν τα στοχευμένα λιποσώματα για την ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ στα hCMEC/D3 κύτταρα και στη συνέχεια in vivo, προκειμένου να διερευνηθεί αν το in vitro μοντέλο του ΑΕΦ μπορεί να προβλέψει την in vivo συμπεριφορά των λιποσωμάτων. Μετά την αξιολόγηση των χαρακτηριστικών των λιποσωμάτων (κατανομή μεγέθους, κ.λπ.) και εφόσον κρίθηκαν ικανά για in vivo χορήγηση, τα λιποσώματα διπλής στόχευσης υποβλήθηκαν σε in vitro δοκιμές ώστε να διερευνηθούν: (i) Η πιθανή κυτταροτοξικότητά τους και (ii) Η πρόσληψη τους από τα κύτταρα του εγκεφάλου και η ικανότητά μεταφοράς τους διαμέσου του in vitro μοντέλου του ΑΕΦ. Σε όλες τις in vitro μελέτες, τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική βελτίωση της ικανότητας στόχευσης του εγκεφάλου με τα λιποσώματα διπλής στόχευσης, (υψηλότερη πρόσληψη από τα κύτταρα και υψηλότερη διαπερατότητα διαμέσου των μονοστοιβάδων των hCMEC/D3) συγκριτικά με τα λιποσώματα χωρίς προσδέτες (απλά PEG-λιποσώματα) ή με τα λιποσώματα που έχουν μόνον έναν προσδέτη, που έδειξαν ικανοποιητικά αποτελέσματα (υψηλότερη πρόσληψη και διαπέραση) σε σχέση με τα PEG-λιποσώματα. Επιπλέον, καμία λιποσωμική μορφή δεν προκάλεσε κυτταροτοξικότητα. Δύο in vivo μελέτες απεικόνισης ζώντων μυών, (με χρήση της χρωστικής DiR για παρακολούθηση των μορφών) επιβεβαίωσε την ικανότητα στόχευσης του εγκέφαλου που έχουν τα λιποσώματα διπλής στόχευσης. Ωστόσο, στην πορεία διενεργήθηκαν επιπρόσθετες in vitro μελέτες αλληλεπιδράσεων αυτών των λιποσωμάτων με τα κύτταρα παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων πρωτεϊνών ορού, για να διερευνηθεί εάν πιθανώς μπορεί να υπάρχει καλύτερη συσχέτιση των in vitro τιμών με τα in vivo αποτελέσματα, σε διαφορετικές πειραματικές συνθήκες.Οι ίδιες in vitro και in vivo μελέτες πραγματοποιήθηκαν και για λιποσώματα που αποτελούνται από διαφορετικές λιπιδικές συστάσεις με μείγματα σφιγγομυελίνης με PA και είναι διακοσμημένα με το πεπτίδιο ApoE σε διαφορετικές πυκνότητες του προσδέτη στην επιφάνεια των λιποσωμάτων (εφόσον κρίθηκαν ικανά για in vivo χορήγηση) καθώς έχει αποδειχθεί στο παρελθόν η ικανότητά τους να δεσμεύονται με υψηλή συγγένεια στα πεπτίδια Αβ1-42. Η κυτταρική πρόσληψη των νανολιποσωμάτων σφιγγομυελίνης με 2.5mol% ApoE ήταν αυξημένη σε σύγκριση με εκείνα με 0.05mol% παρουσία πρωτεϊνών ορού σε ποσοστό 5%, ωστόσο με την αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών ορού στο τροποποιημένο κυτταρικό μοντέλο, η κυτταρική πρόσληψη αυτών μειώθηκε σε όλες τις περιπτώσεις (παρουσία PA ή/και PEG), κάτι το οποίο δεν παρατηρήθηκε στα λιποσώματα σφιγγομυελίνης με ποσοστό ApoE 0.05mol%, ακόμα και παρουσία 50% πρωτεϊνών ορου. Στην in vivo μελέτη στόχευσης του ΑΕΦ, μελετήθηκαν μόνο τα λιποσώματα σφιγγομυελίνης με 0.05mol% πυκνότητα του πεπτιδίου και χωρίς την παρουσία του PA, εφόσον είχαν καλύτερη συμπεριφορά στις in vitro δοκιμές, έχοντας ως δείγματα ελέγχου τα ApoE-λιποσώματα που αποτελούνται από λιπίδιο DSPC. Δεν παρουσιάστηκε αυξημένη ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ, κάτι που όμως πιθανώς να εξαρτάται από την πυκνότητα προσδετών στην επιφάνεια αλλά και από τη λιπιδική δόση που χορηγήθηκε ενδοφλεβίως.Τέλος, αναπτύχθηκαν πολυλειτουργικά λιποσώματα τα οποία εκτός των δύο προσδετών για στόχευση του ΑΕΦ είναι επίσης διακοσμημένα με λιπιδικό παράγωγο κουρκουμίνης το οποίο αναφέρεται ως Treg (το παράγωγο αυτό έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζει πολύ υψηλή συγγένεια για τα πεπτίδια Αβ, όταν είναι ακινητοποιημένο σε λιποσωμικές επιφάνειες), ως πιθανό σύστημα διάγνωσης/θεραπείας για τη νόσο Alzheimer. Βελτιστοποιήθηκε η ακινητοποίηση των προσδετών στην επιφάνεια των λιποσωμάτων, με την αξιολόγηση διαφορετικών μεθοδολογιών και επιλέχθηκε η τεχνική που έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα ως προς το μέγεθος των λιποσωμάτων, την απόδοση ακινητοποίησης των προσδετών και την απόδοση παραγωγής (ανάκτηση λιπιδίων). Αφού πρώτα αποδείχθηκε ότι τα πολυλειτουργικά λιποσώματα έχουν επαρκή σταθερότητα και ακεραιότητα και δεν παρουσίασαν καμία τοξικότητα, στη συνέχεια ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ (σε σύγκριση με τα λιποσώματα διπλής στόχευσης). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα πολυλειτουργικά λιποσώματα φαίνεται να έχουν παρόμοια ικανότητα στόχευσης του ΑΕΦ με εκείνη των λιποσωμάτων διπλής στόχευσης. Οι in vivo μελέτες επιβεβαίωσαν την παρόμοια συμπεριφορά των πολυλειτουργικών λιποσωμάτων και των λιποσωμάτων διπλής στόχευσης σε σχέση με την ικανότητά τους να φτάνουν στον εγκέφαλο, σε καλή συσχέτιση με τις in vitro μελέτες στο κυτταρικό μοντέλο του ΑΕΦ. Τα πολυλειτουργικά λιποσώματα με απλή πυκνότητα προσδετών του ΑΕΦ στην επιφάνειά τους έχουν ελαφρώς υψηλότερα κλάσματα σημάτων DiR στον εγκέφαλο/σώμα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα διπλής πυκνότητας. Με την αύξηση της πυκνότητας των προσδετών στόχευσης του ΑΕΦ στα πολυλειτουργικά λιποσώματα, η ικανότητά τους να στοχεύουν τον ΑΕΦ και να παραμείνουν στον εγκέφαλο μειώνεται, γεγονός το οποίο πιθανώς να οφείλεται στη μερική αλληλεπίδραση μεταξύ του Treg και των αμυλοειδών του εγκεφάλου, ή στην αλληλεπίδραση μεταξύ των προσδετών στόχευσης του ΑΕΦ και των μορίων του Treg (που προκαλεί μείωση της ικανότητας των προσδετών στόχευσης του ΑΕΦ να αλληλεπιδρούν με τους κυτταρικούς υποδοχείς στα κύτταρα του ΑΕΦ).