Ανάπτυξη αναλυτικής μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό φυτοπροστατευτικών προϊόντων στο μέλι

Abstract

This PhD study was primarily focused on the validation, optimization and application for the simultaneous determination of the target compounds (amitraz, bromopropylate, coumaphos and tau-fluvalinate) in honeys. Particular emphasis was given in methods so they were consistent and repeatable and could be used in future research on beehive products. Thirty six samples of various types of honey were analyzed, 19 standard honey samples from the Greek market, 14 samples from beekeepers and 3 biological honeys. In both groups, honeys of various botanical and geographical origin were included. The choice of compounds were the extensive use by beekeepers. A high-performance liquid chromatography system coupled to UV-diode array detector (HPLC/UV-DAD) was used for the target analytes quantification. In this PhD thesis, was held monitoring and confirmation of analytical methodology using Ultra Performance Liquid Chromatography coupled with Mass Spectrometry (UHPLC/LTQ-ORBITRAP MS) and gas chromatography–mass spectrometry (GC/MS). Following the current trend to apply cheaper, miniaturized and more ‘green’ extraction techniques, the so-called QuEChERS approach followed by dispersive solid phase extraction (dSPE) clean-up was selected and modified accordingly for honey analysis. To keep up with this evolution in analytical strategies, generic sample preparation methodologies employing different clean-up techniques, offering reliable analysis of compounds, are needed. In the optimized method, recoveries for the compounds ranged from 78% and 103%. Detection and quantification limits were calculated from 10 μg kg-1 to 20 μg kg-1 and 35 μg kg-1 to 65 μg kg-1 respectively. The linearity, expressed as a correlation coefficient, was over 0.998 in all cases, within a range from each compound’s method quantification limit to 1000 μg kg−1. Matrix effect study revealed slight signal suppression. In all cases, the repeatability and intra-laboratory reproducibility was less than 13%. The developed analytical methodologies were implemented in an EU-wide case study, including samples of different pure categories of honey (pine, fir, thyme, flowers, conifers, sage, citrus flowers and orange blossoms). The future use of the method as a research tool is particularly important and feasible. Overall, in-hive treated acaricides, i.e., amitraz, bromopropylate, coumaphos and tau-fluvalinate, were not detected in any of the analyzed honey samples. The method proposed is simple and reliable validated assay, which can be readily adapted by any laboratory for the quality control and the quantitative determination of residues of the four examined compounds in honey. Based on the results presented in this thesis, honey could be regarded as safe for consumers. There was no contamination of honey with pesticides and the concentrations of acaricide residues did not usually exceed the MRL.

Η εκπόνηση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής πραγματεύεται τη βελτιστοποίηση και εφαρμογή αναλυτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό τεσσάρων επιλεγμένων φυτοφαρμάκων σε μέλια. Ιδιαίτερη βαρύτητα δόθηκε στην όσο το δυνατόν ολοκληρωμένη επικύρωση της μεθόδου, προκειμένου αυτή να είναι σύντομη, σταθερή, επαναλήψιμη και να μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μελλοντικές έρευνες σχετικά με τα προϊόντα της κυψέλης. Στην παρούσα Διατριβή, επιλέχθηκε αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε αναλυτική μέθοδος για τον προσδιορισμό 4 φυτοπροστατευτικών σε μέλια. Η μέθοδος εφαρμόστηκε σε 36 δείγματα. Δέκα εννέα (19) από τα 36 δείγματα ήταν τυποποιημένο μέλι, ενώ τα υπόλοιπα 14 δείγματα συλλέχθηκαν από διάφορους μελοπαραγωγούς των περιοχών των Ιωαννίνων (9), Άρτας (4) και Χανίων (1), ενώ 3 ήταν βιολογικά μέλια της περιοχής του νομού Ιωαννίνων. Κριτήρια για την επιλογή των ενώσεων ήταν η εκτεταμένη χρήση από τους μελισσοκόμους. Για τον προσδιορισμό των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας, σειριακό φωτοδιόδων (HPLC-UV/DAD), με συνολικό χρόνο ανάλυσης τα δεκαπέντε λεπτά. Για την παρακολούθηση και επιβεβαίωση της ύπαρξης Amitraz, Bromopropylate, Coumaphos και Tau-Fluvalinate στο μέλι χρησιμοποιήθηκε σύστημα υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (και συγκεκριμένα ο υβριδικός τροχιακός αναλυτής μάζας Orbitrap), με συνολικό χρόνο ανάλυσης τα δέκα λεπτά και σύστημα αέριας χρωματογραφίας με φασματομετρία μάζας (GC-MS), με συνολικό χρόνο ανάλυσης τα τριάντα λεπτά. Για τον προσδιορισμό των υπό έρευνα ενώσεων στα μέλια επιλέχθηκε η σχετικά πρόσφατη, απλή και ταχεία μέθοδος εκχύλισης QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe). Για να καθοριστούν οι βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης, μελετήθηκε στο στάδιο του καθαρισμού διαφορετικοί συνδυασμοί προσροφητικών. Στη βελτιστοποιημένη μέθοδο, οι ανακτήσεις για τις φυτοπροστατευτικές ενώσεις κυμάνθηκαν από 78% και 103%. Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης υπολογίστηκαν από 10 μg kg-1 έως 20 μg kg-1 και 35 μg kg-1 έως 65 μg kg-1 αντίστοιχα. Ο συντελεστής γραμμικότητας ήταν πάνω από 0.998 σε όλες τις περιπτώσεις, με γραμμική περιοχή από το όριο ποσοτικοποίησης έως περίπου 100 φορές την τιμή αυτή. Η μελέτη επίδρασης υποστρώματος έδειξε ελαφριά ενίσχυση του σήματος. Σε όλες τις περιπτώσεις, η επαναληψιμότητα και η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα ήταν μικρότερη από 13 και 12.5% αντίστοιχα. Η επικύρωση της μεθόδου που αναπτύχθηκε πραγματοποιήθηκε με βάση την ισχύουσα νομοθεσία της Ε.Ε., όπως αυτή ορίζεται στις οδηγίες 2002/657/ΕΚ και SANTE 11813/2017. Η εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα διαφόρων αμιγών κατηγοριών μελιού (πεύκου, ελάτης, θυμαρίσιο, ανθέων, κωνοφόρων, φασκόμηλου, από άνθη εσπεριδοειδών και από άνθη πορτοκαλιάς). Συνολικά, τα αποτελέσματα της εκτεταμένης παρακολούθησης που πραγματοποιήθηκε σε διαφορετικές κατηγορίες μελιού δείχνουν ότι σε κανένα δείγμα είτε από παραγωγούς είτε τυποποιημένου μελιού δεν περιείχαν καμία από τις 4 δραστικές ουσίες που μελετήθηκαν. Με βάση τα αποτελέσματα που παρατίθενται στην παρούσα διατριβή το μέλι αξιολογείται ως απολύτως ασφαλές για τον καταναλωτή, καθώς δεν ανιχνεύτηκαν υπολείμματα φυτοπροστατευτικών ουσιών σε αυτό, ενώ οι προσδιορισθείσες συγκεντρώσεις υπολειμμάτων των ακαρεοκτόνων δεν ξεπέρασαν τα MRLs.