Αναζήτηση της δυνατότητας αξιοποίησης της αναλυτικής μεθόδου MALDI-TOF στην τυποποίηση Β.melitensis σε δείγματα ανθρώπων, αιγών, προβάτων και γάλακτος

Abstract

Brucellosis is one of the most common zoonoses in Greece. Despite the intensive implementation of control programs since 1975, the disease still remains endemic in Greece with severe impacts on public health and livestock production. The frequent under-reporting of the disease, the observation of cross-reactions with the use of the existing methods in brucellosis’ routine diagnosis and the inability of conventional techniques to distinguish vaccine strain Rev-1 from B. melitensis field endemic strains are some of the most significant problems of brucellosis’ surveillance and control programs.In the last years, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) has emerged as a very promising technique in brucellosis diagnosis. The method’s ability on microorganisms’ identification lies on the comparison of their protein profiles with the reference spectra databases. Although MALDI-TOF MS is superior to the conventional and molecular analytical techniques, its use in brucellosis diagnosis is still limited, as Brucella spp. is still not incorporated in the developed protein databases due to its potential bioterrorist use.Unlike other bacteria, identification of brucellae at biotype level is very difficult due to their high intrageneric homology. Until now, several researchers have focused on MALDI-TOF MS identification of brucellae with poor results. Furthermore, to the best of our knowledge, no previous studies have accessed the method’s ability to discriminate vaccine strain Rev-1 from B. melitensis field endemic strains. The objective of this study was to construct a custom database in order to evaluate MALDI-TOF MS to identify Brucella spp. at species level, whereas by the determination of reliable peak biomarkers to discriminate Brucella melitensis at biovar level and Brucella melitensis field endemic strains from vaccine strain Rev-1.Seventy-five Brucella spp. strains were isolated from patients and animals in four geographical districts of Greece during the period interval 1999-2018. The identification of isolates at species and biotype level was performed by molecular and biochemical tests respectively, whereas the discrimination of B. melitensis field endemic strains from vaccine strain Rev-1 was achieved by the PCR-RFLP methodology. Subsequently, all strains were analyzed by the newly constructed reference database and the results were compared with those obtained via molecular and conventional techniques. Evaluation of MALDI-TOF MS discriminatory power among the three biovars of B. melitensis and the differentiation between vaccinal and field infection was performed after supplementing the custom database by additional spectra. Processing of spectra for reliable biomarkers’ selection was achieved by the statistical package MALDIquant in Mass-Up software. Out of 75 strains analyzed by MALDI TOF MS, 73 strains (97,33%) were identified as B. melitensis and two strains (2,67%) were identified as B. abortus, giving scores > 2.300 in the vast majority of strains. Results were 100% comparable to those obtained by molecular and biochemical tests. The Mass-Up analysis indicated four ion peaks in total (5207, 8026, 8038 and 9664 Da) that could serve as potential discriminating biovar peaks (p<0,05 και q<0,05). After biomarkers’ selection was completed, the in-house database was challenged with 62 field strains, not having been used in the database construction. The results indicated that the reference library could identify correctly B. melitensis bv.3 isolates at 75,81%. On the contrary, no classification was achieved for B. melitensis bv. 1 and B. melitensis bv. 2, as the only strains available were used for the in-house database construction. The comparative evaluation of vaccines’ and field strains’ protein profiles revealed the presence of two statistically significant peaks (3528 and 7328 Da) that could serve as candidate biomarkers for their differentiation (p<0,05 and q<0,05). When the in-house database was challenged with field strains, it was concluded that 72 strains (98,63%) were field endemic strains, whereas only one isolate (1,37%) was identified as vaccine strain. These findings were in total agreement with the results of PCR-RFLP method. The new custom reference library is able to identify brucellae at species level with high precision offering in the meantime a more economic and rapid choice in the diagnostic approach of the disease. The method does not seem to be affected by other microorganisms highly related to the genus Brucella, a fact which provides MALDI-TOF MS a superiority to serological tests. Furthermore, its ability to discriminate vaccine from field endemic strains by the use of reliable biomarkers is of major importance in brucellosis’ surveillance and control programs. However, the continuous expansion of the database with additional spectra is considered necessary to increase the method’s dynamic in B. melitensis biotyping and for MALDI-TOF MS wide application in the daily clinical practice.

Η βρουκέλλωση αποτελεί μία από τις συχνότερες ζωονόσους στην Ελλάδα. Παρά τη συστηματική εφαρμογή προγραμμάτων αντιμετώπισης από το 1975, η νόσος εξακολουθεί να ενδημεί στην Ελλάδα με σοβαρές επιπτώσεις στη Δημόσια Υγεία και την κτηνοτροφία. Η συχνή υπο-δήλωση του νοσήματος, η εμφάνιση διασταυρούμενων αντιδράσεων με τη χρήση των υπαρχουσών μεθόδων στην καθημερινή διάγνωση της βρουκέλλωσης και η αδυναμία διάκρισης του εμβολιακού στελεχους Rev-1 από τα φυσικά μολυσματικά στελέχη B. melitensis με τις συμβατικές τεχνικές αποτελούν μερικά από τα σημαντικότερα προβλήματα των προγραμμάτων επιτήρησης και αντιμετώπισης της νόσου.Τα τελευταία χρόνια, η φασματομετρία χρόνου πτήσης με Ιοντισμό Εκρόφησης με Λέιζερ Υποβοηθούμενο από τη Μήτρα (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectrometry - MALDI-TOF MS) αποτελεί μία πολλά υποσχόμενη τεχνική για εφαρμογή στη διάγνωση της βρουκέλλωσης. Η μέθοδος έχει την ικανότητα να ταυτοποιεί μικροοργανισμούς συγκρίνοντας το πρωτεϊνικό τους προφίλ με τα πρωτεϊνικά φάσματα βιβλιοθηκών αναφοράς. Αν και πλεονεκτεί έναντι των υπόλοιπων διαγνωστικών τεχνικών, η εφαρμογή της μεθόδου MALDI-TOF MS στη διάγνωση της βρουκέλλωσης παραμένει ακόμα σχετικά περιορισμένη, γεγονός που οφείλεται κυρίως στις μη πλήρως ενημερωμένες βάσεις δεδομένων λόγω της ενδεχόμενης χρήσης του μικροοργανισμού ως βιολογικό όπλο.Σε αντίθεση με άλλα βακτήρια, η ταυτοποίηση των βρουκελλών σε επίπεδο βιότυπου είναι εξαιρετικά δύσκολη εξαιτίας της μεγάλης γενωμικής ομολογίας μεταξύ των ειδών του γένους. Μέχρι σήμερα, πολλοί ερευνητές προσπάθησαν να τυποποιήσουν τις βρουκέλλες με τη μέθοδο MALDI-TOF MS σημειώνοντας φτωχά αποτελέσματα. Επιπλέον, δε γνωρίζουμε καμία μελέτη που να έχει εξετάσει τη δυνατότητα της μεθόδου στη διάκριση του εμβολιακού στελέχους Rev-1 από φυσικά μολυσματικά στελέχη B. melitensis. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να δημιουργηθεί μία βάση δεδομένων ώστε να αξιολογηθεί η μέθοδος MALDI-TOF MS ως προς την ταυτοποίηση των βρουκελλών σε επίπεδο είδους, ενώ μέσω του προσδιορισμού αξιόπιστων κορυφών - βιοδεικτών να συμβάλει στην τυποποίηση των στελεχών B. melitensis και τη διάκριση των φυσικά μολυσματικών στελεχών B. melitensis από το εμβολιακό στέλεχος Rev-1.Απομονώθηκαν εβδομήντα πέντε στελέχη Brucella spp. από ασθενείς και ζώα σε τέσσερα γεωγραφικά διαμερίσματα της Ελλάδας κατά τη χρονική περίοδο 1999-2018. Η ταυτοποίηση των στελεχών σε επίπεδο είδους και βιότυπου βασίστηκε στη χρήση των μοριακών και βιοχημικών δοκιμών αντίστοιχα, ενώ η διάκριση των μολυσματικών στελεχών B. melitensis από το εμβολιακό στέλεχος Rev-1 προσεγγίστηκε με τη μεθοδολογία της PCR-RFLP. Στη συνέχεια, κατασκευάστηκε μία βιβλιοθήκη αναφοράς με σκοπό την ανάλυση όλων των στελεχών της μελέτης και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά των μοριακών και συμβατικών τεχνικών. H αξιολόγηση της MALDI-TOF MS στη διάκριση των βιότυπων της B. melitensis καθώς και στη διαφοροποίηση της εμβολιακής από τη φυσική λοίμωξη πραγματοποιήθηκε με την ενίσχυση της βιβλιοθήκης αναφοράς με επιπλέον φάσματα. Η επεξεργασία των φασμάτων για την ανίχνευση των βιοδεικτών πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πακέτο MALDIquant του λογισμικού Mass-Up. Από τα 75 στελέχη που αναλύθηκαν, η μέθοδος MALDI-TOF MS κατάφερε να ταυτοποιήσει 73 στελέχη (97,33%) ως B. melitensis και δύο στελέχη (2,67%) ως B. abortus, σημειώνοντας στην πλειοψηφία των στελεχών scores > 2.300. Τα αποτελέσματα ήταν 100% συγκρίσιμα με τα αποτελέσματα των μοριακών και βιοχημικών δοκιμών. Η ανάλυση των φασμάτων με το λογισμικό Mass-Up κατέδειξε συνολικά τέσσερις πρωτεϊνικές κορυφές (5207, 8026, 8038 και 9664 Da), που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί βιοδείκτες για τη διάκριση των βιότυπων της B. melitensis (p<0,05 και q<0,05). Μετά την ανεύρεση των βιοδεικτών, ακολούθησε η αναζήτησή τους στα προφίλ των 62 στελεχών που δε συμμετείχαν στην κατασκευή της βάσης δεδομένων. Tα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βιβλιοθήκη αναφοράς μπορεί να τυποποιήσει το 75,81% των στελεχών B. melitensis bv. 3. Αντίθετα, η διαχωριστική ικανότητα της μεθόδου δε μπόρεσε να εκτιμηθεί για τους άλλους δύο βιότυπους, καθώς τα μόνα διαθέσιμα στελέχη αξιοποιήθηκαν στην κατασκευή της βάσης. Από τη σύγκριση των πρωτεϊνικών προφίλ των φυσικά μολυσματικών στελεχών B. melitensis και των εμβολιακών στελεχών Rev-1 διαπιστώθηκε ότι υπάρχουν δύο στατιστικά σημαντικές κορυφές (3528 και 7328 Da) που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί βιοδείκτες για τη μεταξύ τους διάκριση (p<0,05 και q<0,05). Κατά την αναζήτηση των δεικτών αυτών στα φάσματα των στελεχών της μελέτης προέκυψε ότι 72 στελέχη (98,63%) ήταν φυσικά μολυσματικά, ενώ μόνο ένα στέλεχος (1,37%) ταυτοποιήθηκε ως εμβολιακό. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν σε απόλυτη συμφωνία με τα αποτελέσματα της μεθόδου PCR-RFLP.Η νέα βιβλιοθήκη αναφοράς μπορεί να ταυτοποιήσει τις βρουκέλλες σε επίπεδο είδους με υψηλή ακρίβεια προσφέροντας παράλληλα μία πιο οικονομική και γρήγορη επιλογή στη διαγνωστική προσέγγιση του νοσήματος. Η μέθοδος δεν επηρεάζεται από άλλους συγγενείς μικροοργανισμούς με το γένος Brucella, γεγονός που προσδίδει στη μέθοδο μία υπεροχή έναντι των ορολογικών δοκιμών. Επιπλέον, η ικανότητα της βιβλιοθήκης να διαφοροποιεί την εμβολιακή από τη φυσική λοίμωξη με τη χρήση ειδικών βιοδεικτών θεωρείται μείζονος σημασίας στα προγράμματα επιδημιολογικής επιτήρησης και ελέγχου της βρουκέλλωσης. Ωστόσο, η συνεχής διεύρυνση της βάσης με νέα φάσματα θεωρείται απαραίτητη για την αύξηση της δυναμικής της στην τυποποίηση των στελεχών B. melitensis και τη μελλοντική ευρεία εφαρμογή της μεθόδου MALDI-TOF MS στην καθημερινή κλινικο-εργαστηριακή πράξη.