Επίδραση του συστήματος σηματοδότησης της υπεροικογένειας του TGFβ κατά την ομοιόσταση και παθοφυσιολογία του κεντρικού νευρικού συστήματος

Abstract

The Transforming Growth Factor beta (TGFβ) superfamily comprises more than 30 structurally related members including, among others, TGFβs, Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) and Activins. Signaling by members of this superfamily has been implicated in fundamental processes regulating the homeostasis of the Central Nervous System (CNS), including neurogenesis, differentiation of glia cells, formation of blood-brain barrier and maintenance of its integrity and others. In addition, numerous studies have linked TGFβ superfamily to CNS pathologies affecting a large proportion of the world's population, such as neuroinflammation, tissue damage following mechanical traumatic injuries and neurodegenerative diseases. In fact, several components of this signaling system, including ligands, receptors and intracellular mediators, are upregulated at mRNA and/or protein levels in experimental models of mechanical and/or biochemical – through neurotoxin administration – CNS injuries. Furthermore, increased protein levels of these components have been found in human spinal cord injuries, as well as in the cerebrospinal fluid or the striatum of patients with Parkinson's disease. Despite the extensive characterization of individual components of the TGFβ superfamily system during CNS homeostasis and pathophysiology, data concerning the identity of recipient cells of this action, as well as the way by which these cells decode the complex TGFβ-superfamily system generated signaling-input to produce the desired physiological response at any given time, are still lacking. Τhe precise role of the two branches of this signaling system, the TGFβ/Activin- and the BMP-induced pathways, under CNS pathological conditions is still not fully understood. Is there a functional interplay between these two signaling branches in physiology and pathophysiology? The aim of this thesis was to clarify the above questions using a double transgenic reporter mice system, developed in BRFAA by crossing two transgenic animal lines carrying the genes of Red (RFP) and Green Fluorescent Proteins (eGFP) in their genome, under the control of well-characterized sequences responding selectively to TGFβs/Activins (TGFβ Responsive Elements, TRE-RFP) or BMPs (BMP Responsive Elements, BRE-eGFP), respectively. The potential cellular targets of canonical TGFβ or BMP signaling express the RFP or eGFP protein, respectively. Using this animal model in previous experiments, we found that signaling by members of the TGFβ superfamily is active and confined to various regions of neonatal and adult brain, such as the olfactory bulbs, the cortex, the ventricle walls, the choroid plexus and the vasculature, under homeostatic conditions. Actually, neurons, astrocytes and structural cells of the blood-brain barrier, such as endothelial cells and pericytes, were included among the cellular targets of TGFβ and/or BMP signaling. To investigate the contribution of both TGFβ and BMP signaling branches in CNS pathophysiology, we used a mouse model of penetrating focal brain injury. More specifically, adult wild-type mice were subjected to unilateral acute stab wound injury and brain tissues encompassing injured (ipsilateral) and corresponding intact (contralateral) areas were collected, at different time-points post-injury. Hallmarks of TGFβ-superfamily system activation, such as levels of phosphorylated Smads, ligands and target genes for both TGFβ and BMP pathways, were found upregulated within injured tissues, the first days post-injury. Next, using double transgenic reporter mice we showed that activation of both TGFβ and BMP signaling branches involved primarily reactive astrocytes that demarcated the wound area. In order to gain indirectly insights regarding the role of TGFβ and/or BMP signaling activation in glia cells within the injured tissues, we developed primary glia culture systems, as well as fluorescence-activated cell-sorting protocols for the establishment of purified astrocytic and microglial cultures. The latter were treated with recombinant TGFβ1 and BMP4 and their transcriptomes were analyzed by next-generation sequencing (RNA-Seq). Astrocytes responded substantially to both ligands with considerably overlapping transcriptional profiles. Although microglia responded remarkably well to TGFβ1, they failed to respond robustly to BMP4, a finding that is probably related to the relatively lower mRNA expression levels for BMP-related receptors and Smads, compared to the astrocytic ones.Bioinformatics analysis of the transcriptomic profiles of TGFβ1- or BMP4-treated astrocytes revealed novel pathways crucial for tissue-injury repair and blood-brain barrier restoration, such as activation of cholesterol biosynthesis and transport, production of axonal guidance and extracellular matrix components and regulation of glutamate homeostasis. Moreover, both ligands in astrocytes and TGFβ1 in microglia shifted the phenotype of reactive glia cells towards the anti-inflammatory and tissue-reparatory A2-like and M0/M2-like phenotypes, respectively. Increased expression of selected key components of the in vitro modulated pathways and markers of A2-like astrocytes was confirmed in vivo within the wound area, suggesting that these processes could also be modulated in situ by the integrated action of TGFβ- and/or BMP-mediated signaling. Besides the mechanical penetrating injury, a biochemical brain injury model was also applied, through administration of the mitochondrial neurotoxin MPTP that simulates a parkinsonian phenotype in adult mice. Substantial activation of the TGFβ superfamily signaling system was observed across the nigrostriatal pathway in MPTP-treated animals. Also in this brain injury model, the majority of TRE-RFP and BRE-eGFP positive cells in the striatum and the substantia nigra were identified as astrocytes. Then, stereotactic overexpression of activators or inhibitors of BMP signaling was performed in the substantia nigra of animals, prior to MPTP administration, followed by assessment of their locomotor activity. We observed a relative improvement in some behavioral parameters of animals subjected to Noggin overexpression, suggesting that focal inhibition of BMP signaling in the substantia nigra is probably exerting a neuroprotective action in the ipsilateral nigrostriatal pathway. To sum up, using the murine brain as model system, we uncovered important aspects of the interaction between TGFβ and BMP branches of the TGFβ superfamily signaling system and highlighted the importance of the relative equilibrium of cytokines/members of this system for the establishment of homeostasis and progression of pathology in the CNS. In addition, we identified not only key neuroprotective and/or neurotoxic processes under pathophysiological conditions, but also specific molecular events/mechanisms, which involve glia cells and could be potentially used towards the development of more effective therapeutic approaches in the context of neuroinflammatory disorders and/or traumatic CNS injuries.

Η υπεροικογένεια του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού β (TGFβ) συνίσταται από περισσότερα από 30 μέλη, που σχετίζονται δομικά μεταξύ τους, και περιλαμβάνει τους TGFβs, τις μορφογενετικές πρωτεΐνες των οστών (BMPs), τις Ακτιβίνες και άλλα. Η σηματοδότηση από μέλη της συγκεκριμένης υπεροικογένειας έχει συνδεθεί με θεμελιώδεις διαδικασίες που διέπουν την ομοιόσταση του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), συμπεριλαμβανομένων της νευρογένεσης, της διαφοροποίησης των κυττάρων της γλοίας, της συγκρότησης και διατήρησης της ακεραιότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και άλλων. Επιπλέον, πολυάριθμες μελέτες συσχετίζουν την υπεροικογένεια του TGFβ με παθολογικές καταστάσεις του ΚΝΣ που αφορούν μεγάλο ποσοστό του παγκόσμιου πληθυσμού, όπως η νευροφλεγμονή, οι βλάβες μετά από μηχανικές τραυματικές κακώσεις και οι νευροεκφυλιστικές νόσοι. Μάλιστα, αρκετοί παράγοντες του συγκεκριμένου σηματοδοτικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων προσδετών, υποδοχέων και ενδοκυττάριων τελεστών, υπερεκφράζονται σε επίπεδο mRNA ή/και πρωτεΐνης σε πειραματικά μοντέλα μηχανικού ή/και βιοχημικού τραυματισμού του νευρικού ιστού, μέσω χορήγησης νευροτοξινών. Επιπλέον, έχουν βρεθεί αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα των ίδιων παραγόντων σε κακώσεις του ανθρώπινου νωτιαίου μυελού, καθώς και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ή το ραβδωτό σώμα ασθενών με νόσο Πάρκινσον. Παρά την εκτενή μελέτη μεμονωμένων παραγόντων της υπεροικογένειας του TGFβ κατά την ομοιόσταση και παθοφυσιολογία του ΚΝΣ, τα δεδομένα που αφορούν στην ταυτότητα των κυτταρικών αποδεκτών της δράσης αυτής, καθώς και στον τρόπο με τον οποίο τα κύτταρα αυτά αποκωδικοποιούν τα περίπλοκα σήματα που δέχονται από κυτταροκίνες της υπεροικογένειας ώστε να εκδηλώσουν την κατάλληλη φυσιολογική απόκριση σε μια δεδομένη χρονική στιγμή, παραμένουν ελλιπή και αρκετά ασαφή. Αδιευκρίνιστος παραμένει επίσης ο ακριβής ρόλος της ενεργοποίησης των δύο βασικών κλάδων του συστήματος, της TGFβ- και της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης, σε παθολογικές καταστάσεις του ΚΝΣ. Υπάρχει αλληλεπίδραση των δύο σηματοδοτικών κλάδων σε αποκλίνουσες από την ομοιόσταση συνθήκες;Αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η αποσαφήνιση των παραπάνω ερωτημάτων χρησιμοποιώντας ένα σύστημα διπλά διαγονιδιακών μυών αναφοράς που αναπτύχθηκε στο ΙΙΒΕΑΑ μέσω διασταύρωσης δύο διαγονιδιακών σειρών που φέρουν στο γονιδίωμά τους τα γονίδια της κόκκινης (RFP) και της ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (eGFP) υπό τον έλεγχο καλά χαρακτηρισμένων αλληλουχιών ειδικής απόκρισης σε TGFβs/Ακτιβίνες (TGFβ Responsive Elements, TRE-RFP) ή σε BMPs (BMP Responsive Elements, BRE-eGFP), αντίστοιχα. Οι δυνητικοί κυτταρικοί αποδέκτες της κανονικής TGFβ ή BMP σηματοδότησης εκφράζουν την πρωτεΐνη RFP ή eGFP, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο ζωικό μοντέλο διαπιστώθηκε ότι η σηματοδότηση από μέλη της υπεροικογένειας του TGFβ είναι ενεργή και οριοθετημένη σε διάφορες περιοχές του νεογνικού και του ενήλικου εγκεφάλου υπό ομοιοστατικές συνθήκες, όπως στους οσφρητικούς βολβούς, στο φλοιό, στα τοιχώματα των κοιλιών, στο χοριοειδές πλέγμα και στο αγγειακό δίκτυο. Μάλιστα, στους κυτταρικούς αποδέκτες της TGFβ ή/και της BMP σηματοδότησης περιλαμβάνονταν νευρώνες, αστροκύτταρα και δομικά κύτταρα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, όπως ενδοθηλιακά κύτταρα και περικύτταρα. Προκειμένου να μελετηθεί η συμμετοχή των TGFβ και BMP κλάδων στην παθοφυσιολογία του ΚΝΣ, εφαρμόστηκε ένα μοντέλο εστιακού διεισδυτικού εγκεφαλικού τραυματισμού. Συγκεκριμένα, ενήλικοι μύες αγρίου τύπου υποβλήθηκαν σε μονόπλευρη οξεία κρανιοεγκεφαλική κάκωση και συλλέχθηκαν δείγματα εγκεφαλικού φλοιού που εμπεριείχαν τις τραυματισμένες και τις αντίστοιχες «υγιείς» περιοχές, σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τον τραυματισμό. Χαρακτηριστικοί δείκτες ενεργοποίησης της υπεροικογένειας του TGFβ, όπως η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Smad και η mRNA έκφραση προσδετών και γονιδίων-στόχων, τόσο της TGFβ όσο και της BMP σηματοδότησης, αυξήθηκαν στην περιοχή του τραύματος τις πρώτες ημέρες μετά την κάκωση. Με τη βοήθεια διπλά διαγονιδιακών μυών αναφοράς δείχθηκε ότι η ενεργοποίηση και των δύο σηματοδοτικών κλάδων αφορούσε κυρίως στα δραστικά αστροκύτταρα που οριοθετούσαν την περιοχή μεταξύ υγιούς και τραυματισμένου ιστού. Για την έμμεση διαλεύκανση του ρόλου της ενεργοποίησης της TGFβ- ή/και BMP-επαγόμενης σηματοδότησης στα κύτταρα της γλοίας που συναθροίζονται στο τραύμα, αναπτύχθηκαν συστήματα απομόνωσης και καλλιέργειας πρωτογενούς γλοίας, καθώς και πρωτόκολλα διαχωρισμού αυτών μέσω κυτταρομετρίας ροής για τη λήψη αμιγών αστροκυτταρικών και μικρογλοιακών πληθυσμών. Τα αμιγή κύτταρα διεγέρθηκαν παρουσία ανασυνδυασμένων TGFβ1 και ΒΜΡ4 και το μεταγράφωμά τους αναλύθηκε με τη μέθοδο της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (RNA-Seq). Τα αστροκύτταρα αποκρίθηκαν σημαντικά και στους δύο προσδέτες και μάλιστα παρουσίασαν ιδιαίτερα επικαλυπτόμενα μεταγραφικά προφίλ. Εντούτοις, η μικρογλοία ενώ αντέδρασε εξαιρετικά καλά στον TGFβ1, αποκρίθηκε πολύ ασθενώς παρουσία ΒΜΡ4, γεγονός που πιθανότατα σχετίζεται με τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης ΒΜΡ-σχετιζόμενων υποδοχέων και Smads συγκριτικά με τα αστροκύτταρα. H βιοπληροφορική ανάλυση του μεταγραφώματος των διεγερμένων με TGFβ1 και ΒΜΡ4 αστροκυττάρων ανέδειξε ένα σύνολο κυτταρικών διεργασιών που διέπουν την ιστική επιδιόρθωση και την αποκατάσταση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού έπειτα από τραυματισμό, όπως η βιοσύνθεση και μεταφορά χοληστερόλης, η έκφραση παραγόντων καθοδήγησης νευραξόνων, η παραγωγή συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας και η ρύθμιση της ομοιόστασης του γλουταμινικού οξέος. Επιπλέον, υπό την επίδραση και των δύο προσδετών στα αστροκύτταρα και παρουσία του TGFβ1 στη μικρογλοία, ο φαινότυπος της δραστικής γλοίας μετατοπίστηκε προς τους αντιφλεγμονώδεις και σχετιζόμενους με την ιστική επιδιόρθωση αστροκυτταρικό τύπου Α2 και μικρογλοιακούς τύπου Μ0/Μ2 φαινοτύπους, αντίστοιχα. Η αυξημένη έκφραση αφ’ ενός χαρακτηριστικών παραγόντων που συμμετέχουν στις παραπάνω in vitro ρυθμιζόμενες βιολογικές διεργασίες, και αφ’ ετέρου ειδικών μεταγράφων για τα αστροκύτταρα τύπου Α2, επιβεβαιώθηκε in vivo στην περιοχή του τραύματος, έπειτα από εστιακή κρανιοεγκεφαλική κάκωση, υποδεικνύοντας ότι οι διαδικασίες αυτές ρυθμίζονται πιθανότατα in situ από τη συνεργιστική δράση της TGFβ ή/και της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης. Εκτός του μηχανικού διεισδυτικού τραυματισμού, εφαρμόστηκε κι ένα μοντέλο βιοχημικού τραυματισμού του εγκεφάλου, μέσω χορήγησης της μιτοχονδριακής νευροτοξίνης MPTP για την προσομοίωση παρκινσονικών συμπτωμάτων σε ενήλικους μύες. Παρατηρήθηκε σημαντική ενεργοποίηση του συστήματος της υπεροικογένειας του TGFβ κατά μήκος της μελαινοραβδωτής οδού στα πειραματόζωα όπου χορηγήθηκε ΜΡΤΡ. Και σε αυτό το μοντέλο εγκεφαλικού τραυματισμού, οι κυτταρικοί αποδέκτες της TGFβ και της BMP σηματοδότησης στο ραβδωτό σώμα και τη μέλαινα ουσία ήταν στην πλειοψηφία τους αστροκύτταρα. Στη συνέχεια, διεξήχθη στερεοτακτική υπερέκφραση ενεργοποιητών ή αναστολέων της BMP σηματοδότησης στη μέλαινα ουσία των πειραματοζώων, πριν από τη χορήγηση MPTP, και μελετήθηκε η κινητική τους δραστηριότητα. Παρατηρήθηκε σχετική βελτίωση ορισμένων συμπεριφορικών παραμέτρων στα ζώα όπου υπερεκφράστηκε η Noggin, υποδεικνύοντας ότι αναστολή της BMP-επαγόμενης σηματοδότησης στη μέλαινα ουσία παρέχει πιθανότατα νευροπροστατευτική δράση στην ομόπλευρη μελαινοραβδωτή οδό. Συνοψίζοντας, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο σύστημα μελέτης τον εγκέφαλο του μυός, αποκωδικοποιήθηκαν σημαντικές πτυχές της αλληλεπίδρασης μεταξύ των TGFβ και BMP κλάδων του συστήματος σηματοδότησης της υπεροικογένειας του TGFβ και τονίστηκε η σημασία του σχετικού ισοζυγίου των κυτταροκινών της υπεροικογένειας για τη ρύθμιση της ομοιόστασης και την εξέλιξη της παθολογίας στο ΚΝΣ. Ακόμη, αναδείχθηκαν βασικές νευροπροστατευτικές ή/και νευροτοξικές διεργασίες υπό παθοφυσιολογικές συνθήκες, καθώς και συγκεκριμένα μοριακά γεγονότα/μηχανισμοί, που αφορούν στα κύτταρα της γλοίας και μπορούν να αξιοποιηθούν μελλοντικά στην ανάπτυξη αποτελεσματικότερων θεραπευτικών προσεγγίσεων στο πλαίσιο νευροφλεγμονωδών διαταραχών ή/και τραυματικών κακώσεων του ΚΝΣ.