Διερεύνηση του ρόλου των microRNAs στη ρύθμιση γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη ανευρύσματος κοιλιακής αορτής

Abstract

Objectives: The LRP1 and DAB2IP genes have been suggested as potential candidate genes leading abdominal aortic aneurysm (AAA). The aim of our study was to elucidate whether mir-335-5p and mir-545-3p are regulators of LRP1 expression and mir-363-3p and EZH2 are mediators of DAB2IP, and to investigate the effect of LRP1 expression in other important molecules of AAA pathogenesis, such as MMP2, MMP9 and TSP2. Materials-Methods: Samples were collected from patients during open surgical AAA repair and adjacent non-aneurysmatic regions were used as controls. Relative mRNA expression levels of of genes and miRNAs LRP1 were measured using rt-real time PCR. Western blot was used to quantify the levels of LRP1, MMP2 and MMP9 protein. A functional study followed, testing the effect of mir-335-5p overexpression on LRP1 expression. Results: A significant reduction of both LRP1 mRNA and protein level (1.5 fold and 2.76 fold decrease, respectively) was observed in human AAA tissues compared to controls. AAA tissues showed a significant overexpression of both mir-335-5p (~1.49 fold increase) and mir-545-3p (1.36 fold increase). The Pearson correlation showed a limited negative correlation between LRP1 expression levels and both miRNAs. The functional study showed extremely significant decreased expression of LRP1 in cells overexpressing mir-335-5p. The functional study indicated an extremely significant reduced LRP1 mRNA expression in cells overexpressing mir-335- 5p. MMP2 and MMP9 levels were significantly increased in AAA tissues. No significant difference in expression of TSP2 mRNA was observed. DAB2IP was significantly overexpressed (2.29 times) in AAA tissues, while EZH2 and mir-363-3p were found to be decreased (3.28 and 3.62 times respectively). A limited negative association was found between DAB2IP and EZH2 expression and between DAB2IP and mir-363-3p.Conclusions: In our study, LRP1 reduction in AAA tissues was confirmed and attributed to mediated regulation via mir-335-5p. It is suggested that LRP1 has a direct effect on the regulatory activity of MMPs. We recommend 2 potential mediators, EZH2 and mir-363-3p of DAB2IP expression in AAA tissues. The study of other molecules in the regulation of these genes will elucidate the molecular pathway of the disease.

Στόχοι: Τα γονίδια LRP1 και DAB2IP έχουν προταθεί ως πιθανά υποψήφια γονίδια που οδηγούν στο ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής (ΑΚΑ). Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να αποσαφηνιστεί εάν τα mir-335-5p και mir-545-3p είναι ρυθμιστές της έκφρασης LRP1 και να διερευνηθεί η επίδραση της έκφρασης LRP1 σε άλλα σημαντικά μόρια στην παθογένεση ΑΚΑ, όπως οι ΜΜΡ2, ΜΜΡ9 και TSP2 καθώς και αν το mir-363-3p και το EZH2 είναι ρυθμιστές του DAB2IP.Υλικά-Μέθοδοι: Δείγματα συλλέχθηκαν από ασθενείς κατά τη διάρκεια ανοικτής χειρουργικής επέμβασης ΑΚΑ και παρακείμενες μη ανευρυσματικές περιοχές χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης mRNA των γονιδίων και των miRNAs υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας rt-real time PCR. Με την μέθοδο Western blot ποσοτικοποιήσαμε τα επίπεδα των πρωτεϊνών LRP1, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Λειτουργική μελέτη ακολούθησε, εξετάζοντας την επίδραση της υπερέκφρασης των mir-545-3p και mir-335-5p στην έκφραση του LRP1.Αποτελέσματα: Παρατηρήθηκε μία σημαντική μείωση τόσο του mRNA όσο και της πρωτεΐνης LRP1 (1.5 φορές και 2.76 φορές μείωση, αντίστοιχα) σε ανθρώπινους ιστούς ΑΚΑ σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Τα mir-335-5p (1.49 φορές αύξηση) και mir-545-3p (1.36 φορές αύξηση) εμφανίστηκαν υπερεκφραζόμενα στους ιστούς ΑΚΑ. Η συσχέτιση Pearson έδειξε περιορισμένη αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης LRP1 και των 2 miRNAs. Η λειτουργική μελέτη έδειξε εξαιρετικά σημαντική μειωμένη έκφραση LRP1 στα κύτταρα που υπερεκφράζουν το mir-335-5p. Τα επίπεδα του MMP2 και MMP9 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ΑΚΑ ιστούς. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση του TSP2 mRNA. Το DAB2IP ήταν σημαντικά αυξημένο (2.29 φορές) στους ιστούς ΑΚΑ, ενώ τα EZH2 και mir-363-3p βρέθηκαν μειωμένα (3.28 και 3.62 φορές αντίστοιχα). Περιορισμένη αρνητική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ της έκφρασης DAB2IP και EZH2 και μεταξύ του DAB2IP και του mir-363-3p.Συμπεράσματα: Στη μελέτη μας, η μείωση του LRP1 στους ιστούς ΑΚΑ επιβεβαιώθηκε και αποδόθηκε σε μεσολαβούμενη ρύθμιση μέσω του mir-335-5p. Υποδεικνύεται ότι το LRP1 έχει άμεση επίδραση στη ρυθμιστική δράση των ΜΜPs. Επίσης βρέθηκε αυξημένη έκφραση του DAB2IP σε ιστούς ΑΚΑ. Για τη ρύθμιση αυτή προτείνουμε 2 δυνητικούς μεσολαβητές, τα EZH2 και mir-363-3p. Η μελέτη και άλλων μορίων στη ρύθμιση των γονιδίων αυτών θα διασαφηνίσει το μοριακό μονοπάτι της νόσου.