Ανάπτυξη οπτικών ανοσοαισθητήρων για την ταυτόχρονη ανίχνευση τοξικών ουσιών σε τρόφιμα

Abstract

In this thesis a label-free optical biosensor for the fast simultaneous determination of three mycotoxins, aflatoxin B1 (AFB1), fumonisin B1 (FB1) and deoxynivalenol (DON) and for the determination of ochratoxin A (OTA) in beer samples is presented. The biosensor is based on an array of ten Mach-Zehnder interferometers (MZIs) monolithically integrated along with their respective broad-band silicon light sources onto a single chip (37 mm2). Multi-analyte determination is accomplished by functionalizing the sensing arms of individual MZIs with mycotoxin-protein conjugates. Assay is performed by pumping over the chip mixtures of calibrators or samples with a mixture of specific monoclonal antibodies, followed by reaction with a secondary anti-mouse IgG antibody. An external miniaturized spectrometer was employed to continuously record the transmission spectra of each interferometer. Spectral shifts obtained due to immunoreactions were transformed to phase shifts through Discrete Fourier Transform. The detection limits achieved for AFB1, FB1, DON and OTA were 0.8, 5.6, 20 and 2.0 ng/ml in beer, respectively, while the assay duration for AFB1, FB1, DON was 12 min and for OTA 50 min. Recovery values ranging from 85 to 116% were determined in beer samples spiked with known concentrations of the four mycotoxins. In addition, beers of different types and origin were analysed with the biosensor developed and the results were compared with those provided by established laboratory methods, further supporting the accuracy of the proposed device. The good analytical performance of the biosensor and the small size of the proposed chip provide for the development of a portable instrument for point-of-need determinations.

Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε οπτικός βιοαισθητήρας τύπου Mach-Zehnder για τον προσδιορισμό χωρίς τη χρήση ιχνηθετών τεσσάρων μυκοτοξινών, ωχρατοξίνης Α (ΟΤΑ), αφλατοξίνης Β1 (AFB1), φουμονισίνης Β1 (FB1) και δεοξυνιβαλενόλης (DON), σε δείγματα μπύρας. Ο αισθητήρας βασίστηκε σε μια συστοιχία από δέκα συμβολόμετρα Mach-Zehnder (MZI), κάθε ένα μονολιθικά ολοκληρωμένο με την αντίστοιχη ευρέος φάσματος πηγή φωτός, σε μια μόνο ψηφίδα πυριτίου. Ο προσδιορισμός πολλαπλών αναλυτών επετεύχθη με ακινητοποίηση διαφορετικών ειδικών δεσμευτικών αντιδραστηρίων (προϊόντα συζεύξεως μυκοτοξίνης-πρωτεΐνης) στους διαφορετικούς αισθητήρες της ίδιας ψηφίδας. Η ανάλυση διεξήχθη με διαβίβαση, μέσω εξωτερικής αντλίας, πάνω από τις ψηφίδες, μιγμάτων βαθμονομητών ή δειγμάτων με διαλύματα των ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων, ακολουθούμενη από αντίδραση με διάλυμα αντισώματος αίγας κατά των γ-σφαιρινών ποντικού. Οι αντιδράσεις παρακολουθήθηκαν σε πραγματικό χρόνο με συνεχή καταγραφή των φασμάτων εξόδου, τα οποία στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε διακριτό μετασχηματισμό Fourier για να μετατραπούν οι μετατοπίσεις του φάσματος σε μετατοπίσεις φάσεων. Τα όρια ανίχνευσης που επιτεύχθηκαν για τις AFB1, FB1, DON και ΟΤΑ σε μπύρα ήταν 0,8, 5,6, 20 και 2,0 ng/ml αντίστοιχα, ενώ η διάρκεια της ανάλυσης κατά τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των AFB1, FB1 και DON ήταν 12 λεπτά, ενώ για τον μεμονωμένο προσδιορισμό της ΟΤΑ 50 λεπτά. Οι τιμές ανάκτησης κυμάνθηκαν από 85 έως 116% σε δείγματα μπύρας με γνωστές συγκεντρώσεις των τεσσάρων μυκοτοξινών. Επιπλέον, αναλύθηκαν μπύρες διαφορετικών τύπων και προέλευσης με τον αναπτυχθέντα βιοαισθητήρα και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με εκείνα που παρήχθησαν από καθιερωμένες εργαστηριακές μεθόδους, υποστηρίζοντας περαιτέρω την ακρίβεια του προτεινόμενου βιοαισθητήρα.