Regulation of inflammation in obesity

Abstract

Inflammation underlies a variety of physiological and pathological processes. Over the years tremendous progress has been made in understanding the cellular and molecular events that are involved in inflammatory responses. A controlled inflammatory response is beneficial for the organism in order to maintain homeostasis, protect from infection and repair tissue damage, but it can also become detrimental if not regulated appropriately. Different instigators of inflammation, such as infection and tissue injury, are among the wide spectrum of adverse conditions that induce inflammation. In chronic inflammatory diseases such as Rheumatoid Arthritis, Systemic Lupus Erythematosus, Inflammatory Bowel Diseases and others, pathogenesis occurs due to excessive, inappropriately initiated inflammatory response. Metabolic diseases such as obesity and type II diabetes are also characterized by chronic, low-grade inflammation that has led to the concept of metabolic inflammation (metaflammation). Despite the fact that mechanisms of inflammatory response have been extensively studied, further elucidating the molecular controls of inflammation is of crucial importance. Macrophages are key players in inflammation activated by a wide spectrum of stimuli and acquire a phenotype that ranges from fully pro-inflammatory (M1) to anti-inflammatory, mediating resolution of inflammation and tissue repair (M2). Metabolic inflammation results in changes in macrophage phenotype as well. Inflammed adipose tissue has an increased number of macrophages and these macrophages are pro-inflammatory (M1-type). Effective termination of inflammation is as important as controlled initiation, therefore a plethora of factors exist that act as negative regulators. TLR signaling contributes to inflammation and metaflammation and is negatively regulated by the IL-1 Receptor Associated Kinase M (IRAK-M) protein, which acts as functional decoy to prevent phosphorylation and further signaling by IRAK-4. The world-wide epidemic of obesity has led to a dramatic increase in metabolic diseases associated with metabolic inflammation, hence deciphering the mechanisms governing processes that establish metaflammation, will allow understanding the pathogenesis of related conditions. Adipocytes are now acknowledged as more than cells for lipid storage. They have primary roles in controlling energy homeostasis and secrete hormones and lipids in order to regulate systemic metabolism. Adipose tissue is in a state of inflammation in obesity contributing to low grade systemic inflammation.Given the established importance of inflammation and metabolism in health and disease, the present study focused on analyzing the transcriptional and epigenetic mechanisms of macrophage activation focusing on the mechanisms of regulation of the intracellular TLR-signaling modulator IRAK-M (a negative regulator of the TLR4/LPS signaling). The work also aimed to decipher whether adipocytes can acquire a macrophage-like phenotype in states of inflammation such as obesity and LPS stimulation and how this is be regulated. Using high-throughput targeted siRNA knock-down of genes that are known transcription factors, signaling molecules and epigenetic regulators in macrophages ones affecting IRAK-M activation by LPS were identified. Molecules that had the strongest effect in either up-regulating or down-regulating IRAK-M expression were selected for further validation. The transcription factor C/EBPβ was identified as a transcriptional activator of the IRAK-M gene upon LPS stimulation of macrophages. ChIP experiments showed that C/EBPβ is recruited to IRAK-M promoter shortly after LPS stimulation to activate its transcription. Additional ChIP experiments showed that NFκΒ/p65 and NFκΒ/RelB were also recruited to IRAK-M promoter shortly after C/EBPβ to maintain transcription active. In addition to transcription factors, epigenetic regulators are also key players in the regulation of gene transcription. Targeted siRNA knock-down of EZH2, the PRC2 complex methyl-transferase, as well as stable shRNA expression experiments showed that IRAK-M gene transcription was regulated by this protein upon LPS activation. In parallel, we studied inflammatory responses in adipocytes using Mouse Embryonic Fibroblasts that were differentiated to mature adipocytes as well as primary adipocytes from lean and obese mice. Cells were activated with LPS and their phenotype was analyzed. Results showed that adipocytes acquired an inflammatory phenotype resembling the one observed in macrophages when activated by LPS. Using gene knock-out animals we found that osteopontin regulated inflammatory activation of adipocytes. Ablation of OPN resulted in increased activation of adipocytes since OPN-deficient adipocytes secreted more TNFα, induced higher levels of iNOS producing more nitrites. This effect was found to be mediated by PPARγ and probably independent of LPS-TLR4 signaling.Overall, this study adds to the current knowledge of the regulation of inflammation and metabolic inflammation by deciphering a mechanism of IRAK-M gene transcription and by elucidating a new factor that mediates inflammatory response in adipocytes.

Μια πληθώρα φυσιολογικών και παθολογικών διεργασιών διέπονται από φλεγμονή. Με την πάροδο των ετών έχει γίνει τεράστια πρόοδος στην κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στις φλεγμονώδεις διεργασίες. Μια καλά ρυθμισμένη φλεγμονώδης απάντηση είναι ευεργετική για τον οργανισμό γιατί επιτρέπει να διατηρηθεί η ομοιόσταση, να προστατευτεί από κάποια λοίμωξη και να επιδιορθώσει μια ιστική βλάβη, μπορεί όμως και να αποβεί καταστροφική αν δεν είναι κατάλληλα ρυθμισμένη. Κλασσικοί εκκινητές της φλεγμονής όπως λοιμώξεις και ιστική βλάβη είναι μέσα στο ευρύ φάσμα των δυσμενών καταστάσεων που επάγουν φλεγμονή. Χρόνιες φλεγμονώδεις ασθένειες όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, οι φλεγμονώδεις νόσοι του εντέρου και άλλες οφείλουν την παθογένειά τους σε υπέρμετρη, μη ορθώς εναρχθείσα φλεγμονή. Μεταβολικές νόσοι όπως η παχυσαρκία και ο διαβήτης τύπου ΙΙ επίσης χαρακτηρίζονται απο μία χρόνια χαμηλού βαθμού φλεγμονή, γεγονός που έχει οδηγήσει στην ιδέα της μεταβολικής φλεγμονής. Παρόλο που η φλεγμονώδης αντίδραση έχει μελετηθεί εκτενώς, οι μηχανισμοί με τους οποίους ρυθμίζεται είναι μεγάλης σημασίας. Τα μακροφάγα είναι κύτταρα με κεντρικό ρόλο στη φλεγμονή και ενεργοποιούνται από μια πληθώρα ερεθισμάτων αποκτώντας ένα φαινότυπο που μπορεί να κυμαίνεται από πλήρως προ-φλεγμονώδης (τύπου Μ1) έως αντι-φλεγμονώδης προς τερματισμό της φλεγμονώδους αντίδρασης και ιστικής επιδιόρθωσης (τύπου Μ2). Η μεταβολική φλεγμονή έχει επίσης αντίκτυπο στο φαινότυπο των μακροφάγων. Ο φλεγμαίνων λιπώδης ιστός είναι διηθημένος από περισότερα μακροφάγα τα οποία είναι προ-φλεγμονώδη (Μ1). Η σωστή λήξη της φλεγμονής είναι εξίσου σημαντική με τη σωστή έναρξη γι’ αυτό και υπάρχει μια πληθώρα παραγόντων που δρουν ως αρνητικοί ρυθμιστές. Η TLR σηματοδότηση είναι ενεργή στη φλεγμονή και τη μεταβολική φλεγμονή και ρυθμίζεται αρνητικά από την πρωτεϊνη IRAK-M που εμποδίζει τη φωσφορυλίωση της IRAK-4 σταματώντας την περαιτέρω σηματοδότηση. Η παγκόσμια επιδημία παχυσαρκίας έχει οδηγήσει στην αύξηση των μεταβολικών νόσων που σχετίζονται με αυτή την κατάσταση και ως εκ τούτου χρειάζονται μελέτες που θα αποκαλύψουν τους μηχανισμούς που διέπουν τις διεργασίες με τις οποίες εγκαθιδρύεται η μεταβολική φλεγμονή και θα επιτρέψουν την κατανόηση της παθογένεσης των καταστάσεων αυτών. Τα λιποκύτταρα θεωρούνται πλέον περισσότερο από απλές αποθήκες λιπιδίων. Έχουν πρωταρχικό ρόλο στον έλεγχο της ενεργειακής ομοιόστασης και εκκρίνουν ορμόνες και λιπίδια που ρυθμίζουν άλλους ιστούς. Ο λιπώδης ιστός έχει δειχθεί ότι φλεγμαίνει στην παχυσαρκία και πολλές μελέτες έχουν ασχοληθεί με τη φλεγμονή του λιπώδους ιστού. Δεδομένης της σημασίας της φλεγμονής και της μεταβολικής φλεγμονής στην υγεία αλλά και την ασθένεια, η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στην ανάλυση των μεταγραφικών και επιγενετικών μηχανισμών της ενεργοποίησης των μακροφάγων και πιο συγκεκριμένα στο μηχανισμό ρύθμισης του ενδοκυττάριου ρυθμιστή του TLR μονοπατιού IRAK-M (αρνητικός ρυθμιστής της TLR4/LPS σηματοδότησης). Η παρούσα εργασία στόχευσε επίσης στο να αποσαφηνίσει αν τα λιποκύτταρα μπορούν να αποκτήσουν έναν φαινότυπο τύπου μακροφάγων όπως αυτόν που τα μακροφάγα αποκτούν σε καταστάσεις φλεγμονής όπως η παχυσαρκία και η ενεργοποίηση από LPS και πώς ρυθμιζεται ο φαινότυπος αυτός.Χρησιμοποιώντας μεγάλης κλίμακας στόχευση με siRNA έγινε σίγηση γονιδίων που κωδικοποιούν γνωστούς μεταγραφικούς παράγοντες, σηματοδοτικά μόρια και επιγενετικούς ρυθμιστές ώστε να ταυτοποιηθεί ποιοί επηρεάζουν την ενεργοποίηση του IRAK-M από το LPS. Τα γονίδια των οποίων η σίγηση είχε τη μεγαλύτερη διαφορά στην ενεργοποίηση (είτε προς τα πάνω, είτε προς τα κάτω) της έκφρασης του IRAK-M επιλέχθηκαν για περαιτέρω επιβεβαίωση. Ο μεταγραφικός παράγοντας C/EBPβ ταυτοποιήθηκε ως μεταγραφικός ενεργοποιητής του IRAK-M γονιδίου κατά την ενεργοποίηση των μακροφάγων με LPS. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης έδειξαν ότι ο C/EBPβ στρατολογήθηκε στον υποκινητή του IRAK-M σύντομα μετά το ερέθισμα του LPS ώστε να επάγει τη μεταγραφή του. Επιπλέον πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης έδειξαν ότι οι παράγοντες NFκΒ/p65 και NFκB/RelB στρατολογήθηκαν επίσης στον υποκινητή του IRAK-M λίγο μετά το C/EBPβ ώστε να κρατήσουν ενεργή τη μεταγραφή. Εκτός από τους μεταγραφικούς παράγοντες υπάρχουν και οι επιγενετικοί ρυθμιστές που παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής. Σίγηση του EZH2 γονιδίου, που είναι η μεθυλοτρανσφεράση του συμπλόκου PRC2, έδειξε ότι ρυθμίζει επίσης τη μεταγραφή του IRAK-M γονιδίου στα μακροφάγα κατά την ενεργοποίηση με LPS.Σε παράλληλα πειράματα μελετήθηκαν οι φλεγμονώδεις αντιδράσεις των λιποκυττάρων χρησιμοποιώντας μυικούς εμβρυονικούς ινοβλάστες που διαφοροποιήθηκαν σε ώριμα λιποκύτταρα, καθώς και πρωτογενή λιποκύτταρα από φυσιολογικά και παχύσαρκα ποντίκια. Τα κύτταρα ενεργοποιήθηκαν με LPS και αναλύθηκε ο φαινότυπός τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα λιποκύτταρα ενεργοποιήθηκαν και απέκτησαν έναν φλεγμονώδη φαινότυπο που ομοιάζει με αυτό τον μακροφάγων όταν ενεργοποιούνται από LPS ή όταν βρίσκονται σε ένα φλεγμονώδες περιβάλλον όπως στην περίπτωση της παχυσαρκίας. Χρησιμοποιώντας knock-out ζώα βρέθηκε ότι η Osteopontin είχε ένα ρόλο στη ρύθμιση της ενεργοποίησης της φλεγμονής στα λιποκύτταρα. Απουσία OPN είχε ως αποτέλεσμα την υπερ-ενεργοποίηση των λιποκυττάρων καθώς τα OPN knock-out λιποκύτταρα παρήγαγαν περισσότερο TNFα, περισσότερη iNOS και περισσότερα νιτρικά. Το αποτέλεσμα αυτό φάνηκε να διαμεσολαβείται από PPARγ και πιθανότατα ανεξάρτητα από την LPS/TLR4 σηματοδότηση.Συνολικά, η παρούσα μελέτη προσθέτει στη γνώση της ρύθμισης της φλεγμονής και της μεταβολικής φλεγμονής αποσαφηνίζοντας έναν μηχανισμό της μεταγραφής του IRAK-M γονιδίου και ένα νέο παράγοντα που διαμεσολαβεί τη φλεγμονώδη αντίδραση στα λιποκύτταρα.