Ο ρόλος της φλεγμονής και του οξειδωτικού stress στον ινσουλινοεξαρτώμενο σακχαρώδη διαβήτη

Abstract

INTRODUCTION: Diabetes mellitus type 1 (DM1) is a chronic disease of childhood and young adulthood and is often accompanied by severe micro- and macro-vascular complications. Key role in their development plays excess glucose through non-enzymatic interaction with molecules and final production of advanced glycation end products, AGEs (main representative the Ne-(carboxymethyl)lysine, CML). The AGEs linked to their receptor RAGE (mainly) induce the intracellular production of oxidants (malondialdehyde, MDA), proinflammatory (cyclooxygenase-2, COX-2) and pre-thrombotic agents. This leads to the activation of blood mononuclear cells (PBMCs), recruitment to the sub-endothelial space through adhesion molecules (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1; vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) and development of vascular malfunction. Protective role in these processes play the soluble forms of RAGE, sRAGE, who are produced by alternative splicing of the RAGE gene or by enzymatic catalysis (matrix metalloproteinase-9, MMP-9) and remove AGEs from the circulation, inhibiting their actions. Also protective antioxidant mechanisms are developed and evaluated by methods such as plasma ferric reducing ability (FRAP). AIM / MATERIALS - METHODS: In order to investigate the possible role of inflammatory processes and oxidative stress in the development of diabetic complications, in PBMCs of 110 children and young adults (age: 4-29 years) with DM1 and 124 non-diabetic age-matched controls, we studied: 1) by PCR, gene expression (mRNA) of: COX-2, RAGE, MMP-9, ICAM-1, VCAM-1 and 2) by Western blotting, protein expression of: COX-2, RAGE. In the plasma of the same individuals we measured: 3) by ELISA, plasma levels of: sRAGE, CML, MMP-9 and 4) by spectrophotometry, the MDA plasma levels and FRAP. RESULTS: The study showed that: RAGE gene expression was increased in: 1) DM1 patients compared with controls, 2) DM1 patients >13yrs old compared with their respective controls and 3) DM1 patients with >5yr disease duration compared with controls. esRAGE protein expression presented: 1) increasing trend in DM1 patients compared to controls, a trend that remained even after separation by age (≤ or >13yrs old), 2) increased in DM1 patients with disease duration >5yrs compared to DM1 patients with disease duration ≤5yrs and controls. COX-2 gene expression was increased: 1) in DM1 patients in total, 2) in DM1 patients with age >13yrs and 3) those with >5yrs of disease duration, compared to their respective controls. COX-2 protein expression showed: 1) reduction trend in total DM1 patients compared with their respective controls, trend that remained regardless of the duration of the patients' disease, 2) reduction in DM1 patients >13yrs old compared to DM1 ≤13yrs old patients and their age matched controls, 3) reduction in DM1 patients with HbA1c≤7% compared to DM1 patients with HbA1c:7,1-8% and their respective controls. MMP-9 gene expression showed no significant difference between DM1 patients and controls, in total or in separated groups. MMP-9 plasma levels: 1) showed no significant differences between the DM1 patients and their respective controls in total or when grouped according to their age or DM1 duration, 2) were significantly increased in DM1 patients while increasing levels of HbA1c, with maximum in HbA1c:9% and followed a gradual reducing with HbA1c>9%. ICAM-1 gene expression showed no significant difference between DM1 patients and their controls in total or in separated groups. VCAM-1 gene expression was: 1) reduced in DM1 patients compared with controls, in total, independently of the duration of the disease, 2) decreased in patients DM1>13yrs old compared with their respective controls. sRAGE plasma levels: 1) showed no significant differences between DM1 patients and the controls in total or when grouped according to their age or DM1 duration, 2) showed an increasing trend in DM1 patients with increased levels of HbA1c (especially with HbA1c>9%). CML plasma levels showed: 1) increasing trend in DM1 patients compared with the controls in total, 2) increase in DM1 patients ≤13yrs old and those with disease duration ≤5yrs, compared with their respective controls. MDA plasma levels were increased in DM1 patients compared to controls, independently of the age or the duration of the disease. FRAP plasma levels showed: 1) increase in DM1 patients compared to controls, in total, 2) increasing trend in DM1 patients aged ≤ and >13yrs and 3) in DM1 patients with disease duration ≤5yrs and >5yrs, compared to controls. CONCLUSIONS: It seams that younger DM1 patients develop protective mechanisms against glycation, inflammation and oxidative stress that protect them from the development of diabetic complications.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 1 (ΣΔ1) αποτελεί μια χρόνια νόσο της παιδικής και νεαρής ενήλικης ζωής και συχνά συνοδεύεται από σοβαρές μικρο- και μακρο-αγγειακές επιπλοκές. Βασικό ρόλο στην ανάπτυξή τους διαδραματίζει η πλεονάζουσα γλυκόζη μέσω της μη ενζυματικής αλληλεπίδρασης με πλήθος μορίων και τελική παραγωγή των τελικών προϊόντων προχωρημένης γλυκοζυλίωσης, AGEs (κύριος εκπρόσωπος η Nε-(καρβοξυμεθυλ)-λυσίνη, CML). Τα AGEs συνδεόμενα με τον υποδοχέας τους RAGE (κυρίως), σηματοδοτούν την ενδοκυττάρια παραγωγή οξειδωτικών (μαλονδιαλδεΰδη, MDA), προ-φλεγμονωδών (κυκλοοξυγενάση-2, COX-2) και προ-θρομβωτικών παραγόντων. Αυτό οδηγεί στην ενεργοποίηση των μονοπύρηνων κυττάρων του αίματος (PBMCs), τη μετακίνησή τους στον υπενδοθηλιακό χώρο μέσω προσκολλητικών μορίων (διακυττάριο μόριο προσκόλλησης-1, ICAM-1; πρωτεΐνη προσκόλλησης αγγειακών κυττάρων-1, VCAM-1) και την ανάπτυξη αγγειακής δυσλειτουργίας. Προστατευτικό ρόλο σε αυτές τις διαδικασίες παίζουν οι διαλυτές μορφές του RAGE, sRAGE (soluble RAGE), που παράγονται με εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου (esRAGE) ή με ενζυματική διατομή από πρωτεάσες (μεταλλοπρωτεϊνάση-9, ΜΜΡ-9) και απομακρύνουν τα AGEs από την κυκλοφορία, εμποδίζοντας τις δράσεις τους. Παράλληλα, αναπτύσσονται και προστατευτικοί αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί που αξιολογούνται με μεθόδους όπως η ικανότητα μείωσης του σιδήρου του πλάσματος (FRAP). ΣΚΟΠΟΣ / ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ: Με σκοπό να διερευνήσουμε τον πιθανό ρόλο των διεργασιών της φλεγμονής και οξειδωτικού stress στην ανάπτυξη των διαβητικών επιπλοκών, σε PBMCs 110 παιδιών και νεαρών ενηλίκων (ηλικίας 4-29 ετών) με ΣΔ1 και 124 μη διαβητικών μαρτύρων αντίστοιχης ηλικίας, μελετήσαμε: 1) με PCR τη γονιδιακή έκφραση (mRNA) των: COX-2, RAGE, MMP-9, ICAM-1, VCAM-1 και 2) με ανοσοαποτύπωση κατά Western την πρωτεϊνική έκφραση των: COX-2, RAGE. Στο πλάσμα των ίδιων ατόμων μετρήσαμε: 3) με ELISA τα επίπεδα πλάσματος των: sRAGE, CML, MMP-9 και 4) με φασματοφωτομετρία τα επίπεδα πλάσματος MDA και το FRAP. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η μελέτη έδειξε ότι: Η γονιδιακή έκφραση του RAGE ήταν αυξημένη: 1) στους ΣΔ1 ασθενείς σε σύγκριση με τους μάρτυρες, στο σύνολό τους, 2) στους ΣΔ1 ασθενείς ηλικίας >13ετών σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες και 3) στους ΣΔ1 ασθενείς με >5έτη διάρκεια νόσου σε σχέση με τους μάρτυρες. Η πρωτεϊνική έκφραση του esRAGE παρουσίασε: 1) τάση αύξησης στους ΣΔ1 ασθενείς σε σύγκριση με τους μάρτυρες στο σύνολό τους, τάση που παρέμεινε ακόμα και μετά το διαχωρισμό βάσει ηλικίας (≤ ή > 13ετών), 2) αύξηση στους ΣΔ1 ασθενείς με διάρκεια νόσου >5έτη σε σχέση με ΣΔ1 ασθενείς με διάρκεια νόσου ≤5έτη και με τους μάρτυρες. Η γονιδιακή έκφραση της COX-2 ήταν αυξημένη: 1) στους ΣΔ1 ασθενείς στο σύνολό τους, 2) στους ΣΔ1 ασθενείς με ηλικία >13ετών και 3) σε αυτούς με >5έτη διάρκεια νόσου, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Η πρωτεϊνική έκφραση της COX-2 παρουσίασε: 1) τάση μείωσης στο σύνολο των ΣΔ1 ασθενών σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες, τάση που παρέμεινε ανεξαρτήτως της διάρκειας νόσου των ασθενών, 2) μείωση στους ΣΔ1 ασθενείς με ηλικία >13ετών σε σύγκριση με τους ΣΔ1 ασθενείς ≤13ετών και τους αντίστοιχους μάρτυρες, 3) μείωση στους ΣΔ1 ασθενείς με HbA1c ≤7% σε σχέση με τους ΣΔ1 ασθενείς που είχαν HbA1c: 7,1-8% και τους αντίστοιχους μάρτυρες. Η γονιδιακή έκφραση της MMP-9 δεν παρουσίασε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των ΣΔ1 ασθενών και των μαρτύρων ούτε στο σύνολό τους, ούτε στις επιμέρους ομαδοποιήσεις. Τα επίπεδα πλάσματος της MMP-9: 1) δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ΣΔ1 ασθενών και των αντίστοιχων μαρτύρων στο σύνολό τους ή όταν ομαδοποιούνταν ανάλογα με την ηλικία ή τη διάρκεια νόσου, 2) βρέθηκαν σημαντικά αυξανόμενα στους ΣΔ1 ασθενείς με παράλληλα αυξανόμενα επίπεδα HbA1c, με μέγιστο στην HbA1c=9% και ακολουθούμενη σταδιακή μείωση των επιπέδων της ΜΜΡ-9 με HbA1c >9%. Η γονιδιακή έκφραση του ICAM-1 δεν παρουσίασε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των ΣΔ1 ασθενών και των μαρτύρων στο σύνολό τους ή στις επιμέρους ομαδοποιήσεις. Η γονιδιακή έκφραση του VCAM-1 ήταν: 1) μειωμένη στο σύνολο των ΣΔ1 ασθενών σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ανεξαρτήτως της διάρκειας της νόσου τους, 2) μειωμένη στους ΣΔ1 ασθενείς >13ετών σε σύγκριση με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Τα επίπεδα πλάσματος του sRAGE: 1) δεν παρουσίασαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ΣΔ1 ασθενών και των μαρτύρων στο σύνολό τους ή όταν ομαδοποιούνταν ανάλογα με την ηλικία ή τη διάρκεια νόσου, 2) παρουσίασαν τάση αύξησης στους ΣΔ1 ασθενείς με τα αυξανόμενα επίπεδα της HbA1c (ειδικότερα με HbA1c >9%). Τα επίπεδα πλάσματος του CML παρουσίασαν: 1) τάση αύξησης στους ΣΔ1 ασθενείς σε σχέση με του μάρτυρες στο σύνολό τους, 2) αύξηση στους ΣΔ1 ασθενείς ηλικίας ≤13ετών και σε αυτούς με διάρκεια νόσου ≤5έτη, σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Τα επίπεδα πλάσματος του MDA ήταν αυξημένα στους ΣΔ1 ασθενείς σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ανεξαρτήτως της ηλικίας ή τη διάρκεια της νόσου τους. Τα επίπεδα πλάσματος του FRAP εμφάνισαν: 1) αύξηση στους ΣΔ1 ασθενείς σε σχέση με τους μάρτυρες, στο σύνολό τους, 2) τάση αύξησης στους ΣΔ1 ασθενείς με ηλικία ≤ και >13ετών σε σύγκριση με τους μάρτυρες και 3) αύξηση στους ΣΔ1 ασθενείς με διάρκεια νόσου ≤5έτη και >5έτη σε σύγκριση με τους μάρτυρες. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Φαίνεται πως οι νεότεροι ΣΔ1 ασθενείς διαθέτουν προστατευτικούς μηχανισμούς έναντι της γλυκοζυλίωσης, της φλεγμονής και του οξειδωτικού stress που πιθανόν τους καθιστούν ικανούς να μειώνουν των κίνδυνο έναντι της ανάπτυξης των διαβητικών αγγειακών επιπλοκών.