Η αλληλεπίδραση μεταβιβαστών φλεγμονής και υποεπιθηλιακών μυοϊνοβλαστών στην ινωτική διεργασία των ιδοπαθών φλεγμονωδών εντεροπαθειών ως στόχος νέων θεραπευτικών στρατηγικών

Abstract

Introduction - Inflammatory Bowel Diseases (IBDs), Crohn’s Disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC), are characterized by chronic inflammation of the gastrointestinal tract, with unknown etiopathogenesis and immunologic mechanisms involved. Transmural fibrosis development is one of the main characteristics of CD and it is characterized by an increased production of inflammatory and pro-fibrotic mediators that ultimately lead to the activation, proliferation and differentiation of intestinal fibroblasts to myofibroblasts, as well as infiltration of myofibroblasts of different origin. The etiopathogenesis of fibrosis is mostly unknown, but the current literature suggests that innate (TL1A) and adaptive (Th1, Th2, Th17 and Treg) immune responses play a significant role in intestinal fibrogenesis. Tumor necrosis factor (TNF)-like cytokine 1A (TL1A) is a member of TNF’s superfamily, binds to the receptors, DR3 and DcR3 and so far, there is enough evidence suggesting that both TL1A and its receptors are implicated in IBD. Pro-inflammatory mediators of the innate or adaptive immunity induce pro-fibrotic effects on myofibroblasts, driving them towards a fibrotic phenotype. In particular, Th2- and Th17- related cytokines, such as IL-13 and IL-17, respectively, induce mostly pro-fibrotic effects, whereas, Th1- related cytokines, such as IFN-γ, promote mostly anti-fibrotic effects. The expression of TL1A and its receptors, DR3 and DcR3, in colonic subepithelial myofibroblasts (cSEMFs) and in colonic epithelial cells HT-29, as well as the effect of immune responses, Th1, Th2, Th17 and Treg, in cSEMFs’ biologic activity and fibrosis, are poorly studied. Therefore, it would be of interest to investigate the effect of inflammatory mediators in these cells’ physiology and in fibrogenesis. Aim and Objectives - The aim of the present PhD thesis was to study the role and implication of cSEMFs in the inflammatory process, which characterizes IBD, and leads to the onset of fibrosis. For this purpose, we studied the pathogenetic mechanisms involved in the fibrotic process and their regulatory factors, which could serve as new pharmacological targets.In particular, during the first part of the current PhD thesis, one of our objectives was to study the expression of TL1A and its receptors, DR3 and DcR3, in primary human cSEMFs from healthy controls, under inflammatory conditions that resemble IBD and in primary human cSEMFs from patients with CD. In addition, we investigated whether colonic epithelial cells HT-29 express the receptors DR3 and DcR3, under inflammatory conditions and whether there is a crosstalk between HT-29 cells and cSEMFs. During the second part, one of our objectives was to perform an expression mapping of all interleukin receptors, implicated in IBD, in primary human cSEMFs, and to examine the way that pro-inflammatory cytokines of innate immunity, as well as Lipopolysaccharide (LPS) alter this expression. In addition, we studied the effect of adaptive immune responses (Th1, Th2, Th17 and Treg) in the expression of pro-fibrotic factors by cSEMFs, as well as, in their migratory capacity. The ultimate goal of the present PhD thesis was to better understand the etiopathogenetic mechanisms implicated in intestinal fibrosis, and to highlight possible new pharmacological targets that will be part of novel and effective therapeutic strategies for the treatment of intestinal fibrosis. Materials and Methods - In order to achieve our aims, we initially isolated cSEMFs from colonic biopsies obtained from healthy individuals and patients with CD. We also cultured the cell lines, HT-29 and 18CO, which are colonic epithelial cells and colonic embryonic fibroblasts, respectively. Regarding the first part of the present PhD thesis, we first stimulated cSEMFs and 18CO with IL-1α and/or TNF-α, in order to study the mRNA and protein expression of TL1A and its receptors, DR3 and DcR3. Next, we stimulated HT-29 cells with IL-1α, TNF-α and IFN-γ, cultured tissue biopsies from patients with CD and their supernatants were used as stimuli in cSEMFs for the study of mRNA and protein expression of TL1A and its receptors, DR3 and DcR3. We also studied the mRNA and protein expression of TL1A and its receptors, DR3 and DcR3 in cSEMFs from patients with CD. Next, HT-29 cells were stimulated with IL-1α, TNF-α and IFN-γ, in order to investigate the mRNA and protein expression of DR3 and DcR3 receptors. Finally, we stimulated HT-29 cells with TL1A and we examined its effect in the induction of IL-8 mRNA expression.Regarding the second part, we initially stimulated cSEMFs with IL-1α and/or TNF-α, as well as with LPS, in order to investigate the basal and the pro-inflammatory cytokine-induced mRNA and protein expression of interleukin receptors. Next, cSEMFs were stimulated with Th1- (TNF-α and/or IFN-γ), Th2- (IL-4 and/or IL-13), Th17- (IL-17 and/or IL-22 and/or IL-23) and Treg- (IL-10 ad/or TGF-β) related cytokines, in order to investigate the mRNA expression of pro-fibrotic factors, collagen type I and III, fibronectin, α-SMA, TF, metalloproteinase-1 (MMP-1), MMP-9, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) and TIMP-2 and the protein expression of collagen and fibronectin. Finally, we stimulated cSEMFs with Th1- (TNF-α and/or IFN-γ), Th2- (IL-4 and/or IL-13), Th17- (IL-17 and/or IL-22 and/or IL-23) and Treg- (IL-10 ad/or TGF-β) related cytokines, in order to examine their effect in cSEMFs’ migratory capacity via scratch test assay. During the mRNA expression studies, total RNA was isolated from cultured cells, cDNA synthesis was performed and the real time rt-PCR method was used for the detection of mRNA expression levels. Protein expression studies were performed using either immunofluorescence, or the ELISA method. Collagen protein levels were measured using the Sircol method. Statistical analysis was performed with Student's t test. Results - Regarding the first part, cSEMFs and 18CO cells stimulated with the pro-inflammatory cytokines IL-1α and/or TNF-α, abundant in the inflamed intestinal mucosa of patients with IBD, expressed upregulated levels of TL1A mRNA and protein expression. Tissue supernatants from cultured biopsies of patients with CD induced the TL1A mRNA and protein expression in cSEMFs. cSEMFs isolated from patients with CD were found to express TL1A. Stimulated HT-29 cells with IL-1α, TNF-α and IFN-γ expressed upregulated mRNA and protein levels of DR3 receptor, and their supernatants induced the mRNA and protein expression of TL1A in cSEMFs. HT-29 cells stimulated with TL1A expressed upregulated mRNA levels of IL-8. Regarding the second part, a basal expression of interleukin receptors (Τh1: IFNGR1, IFNGR2, TNFRSF1A, IL12RB2, IL1R1 and IL1R2, Th2: IL4R and IL13RA2, Th17: IL22RA1, Treg: IL10RA, IL10RB, TGFBR1 and TGFBR2) was found in cSEMFs isolated from healthy individuals. Stimulation of cSEMFs with pro-inflammatory cytokines IL-1α and/or TNF-α had a positive or negative effect in interleukin receptor expression patterns. LPS stimulation did not cause any statistically significant upregulation or downregulation of interleukin receptors expression. cSEMFs stimulated with Th1- related cytokines expressed upregulated mRNA levels of TF and MMP-1, upregulated protein levels of collagen and fibronectin and reduced mRNA levels of α-SMA, MMP-9 and migration rate. Th2- related cytokines induced an upregulation of mRNA collagen, TF, α-SMA and MMP-1 expression and migration rate in cSEMFs and a downregulation of fibronectin protein and MMP-9 mRNA expression. Th17- related cytokines had a mixed effect in cSEMFs; IL-17 and IL-23 induced an upregulation of fibronectin expression, whereas IL-22 stimulation resulted in reduced fibronectin and TF expression. Similar results were obtained from scratch test assay; IL-17 and IL-22 reduced migratory rate, whereas IL-23 enhanced it. Additionally, IL-23 induced the mRNA expression of both MMP-1 and TIMP-1. Finally and as expected, TGF-β proved to be the most potent pro-fibrotic factor, as it upregulated all studied pro-fibrotic mediators, as well as migratory capacity of cSEMFs. Conclusions - In the present PhD thesis, we concluded that cSEMFs are directly implicated in intestinal inflammation and that innate and adaptive immune responses have a significant role in the development of intestinal fibrosis. Additionally, the current PhD thesis highlights new possible pharmacological targets, whose further study may lead to the development of novel and effective therapeutic strategies for the treatment of intestinal fibrosis.

Εισαγωγή - Οι Ιδιοπαθείς Φλεγμονώδεις Νόσοι του Εντέρου (ΙΦΝΕ), Νόσος του Crohn (ΝC) και Ελκώδης Κολίτιδα (ΕΚ), αποτελούν χρόνια φλεγμονώδη νοσήματα του γαστρεντερικού συστήματος, αγνώστου αιτιολογίας, των οποίων η αιτιοπαθογένεια διέπεται από ανοσολογικούς μηχανισμούς. Η ανάπτυξη διατοιχωματικής ίνωσης του εντέρου αποτελεί ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της NC και χαρακτηρίζεται από αυξημένη παραγωγή μεταβιβαστών της φλεγμονής και προ-ινωτικών παραγόντων που οδηγούν στην ενεργοποίηση, πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των ινοβλαστών σε μυοϊνοβλάστες στον εντερικό βλεννογόνο, καθώς και προσέλκυση νέων μυοϊνοβλαστών. Η αιτιοπαθογένεια της ίνωσης μέχρι στιγμής παραμένει άγνωστη, αλλά δεδομένα αναφέρουν πως οι ανοσολογικές αποκρίσεις της έμφυτης (TL1A) και της ειδικής ανοσίας (Th1, Th2, Th17 και Treg) συμβάλλουν σημαντικά στην ανάπτυξη εντερικής ίνωσης.Ο TL1A (tumor necrosis factor (TNF)-like cytokine 1A, TL1A) ανήκει στην υπεροικογένεια του TNF, προσδένεται στους υποδοχείς, death-domain receptor 3 (DR3) και decoy receptor 3 (DcR3) και μέχρι στιγμής, υπάρχουν αρκετές αναφορές στην βιβλιογραφία που συσχετίζουν τον TL1A και τους 2 υποδοχείς του με τις ΙΦΝΕ. Οι φλεγμονώδεις μεταβιβαστές της έμφυτης ή της ειδικής ανοσίας (Th1, Th2 και Th17) προκαλούν αντίστοιχες ινωτικές αντιδράσεις στους μυοϊνοβλάστες, οδηγώντας τους σε έναν ινωτικό φαινότυπο. Συγκεκριμένα, φλεγμονώδεις παράγοντες της Th2 και της Th17 ανοσολογικής απόκρισης, όπως η interleukin (IL)-13 και η IL-17 αντίστοιχα, οδηγούν κατά κύριο λόγο σε ινωτικές διεργασίες, ενώ αντίθετα, παράγοντες της Th1 ανοσολογικής απόκρισης φαίνεται να μην συνδράμουν ενεργά στη δημιουργία της ίνωσης, αλλά να δρουν προς την αντίθετη κατεύθυνση, με την IFN-γ να εμφανίζει αντι-ινωτικές ιδιότητες. Η μελέτη της έκφρασης του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3, στους εντερικούς υποεπιθηλιακούς μυοϊνοβλάστες (ΕΥΜ) και στα κολονικά επιθηλιακά κύτταρα ΗΤ-29, καθώς και η επίδραση των ανοσολογικών αποκρίσεων, Th1, Th2 και Th17, στη βιολογία των ΕΥΜ και στην εμπλοκή τους στην ιστική αναδιοργάνωση και στην ίνωση, αποτελούν πεδίο έρευνας ελάχιστα μελετημένο και επομένως, χρήζει ιδιαίτερου ενδιαφέροντος η διερεύνηση της επίδρασης των στοιχείων της φλεγμονής στη φυσιολογία αυτών των κυττάρων και στη διεργασία της ίνωσης. Σκοπός και Στόχοι - Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη του ρόλου και της εμπλοκής των υποεπιθηλιακών μυοϊνοβλαστών στις φλεγμονώδεις διεργασίες που διέπουν τις ΙΦΝΕ και οδηγούν στην ανάπτυξη ίνωσης. Για τον σκοπό αυτό, διερευνήθηκαν οι παθογενετικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ινωτική διαδικασία και οι παράγοντες που τους ρυθμίζουν άμεσα ή έμμεσα, οι οποίοι θα μπορούσαν να αποτελέσουν νέους θεραπευτικούς στόχους.Συγκεκριμένα, κατά το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, στόχος ήταν ο έλεγχος της έκφρασης του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3, σε πρωτογενείς ανθρώπειους ΕΥΜ φυσιολογικών μαρτύρων, υπό συνθήκες φλεγμονής που σχετίζονται με τις ΙΦΝΕ και σε ΕΥΜ ασθενών με NC. Επιπλέον, έγινε διερεύνηση της έκφρασης των υποδοχέων DR3 και DcR3 σε κολονικά επιθηλιακά κύτταρα ΗΤ-29, υπό συνθήκες φλεγμονής, καθώς και μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ των ΕΥΜ και των ΗΤ-29 κυττάρων. Κατά το δεύτερο σκέλος, στόχος ήταν ο έλεγχος και η χαρτογράφηση της έκφρασης όλων των υποδοχέων των ιντερλευκινών, που σχετίζονται με τις ΙΦΝΕ, σε πρωτογενείς ανθρώπειους ΕΥΜ φυσιολογικών μαρτύρων, καθώς και η μελέτη της επίδρασης των προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών της έμφυτης ανοσίας στην τροποποίηση της έκφρασης των συγκεκριμένων υποδοχέων στους ΕΥΜ. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση των ανοσολογικών αποκρίσεων (Th1, Th2, Th17 και Treg) στην επαγόμενη έκφραση προ-ινωτικών μορίων από τους ΕΥΜ και στην μεταναστευτική τους ικανότητα. Απώτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η κατανόηση των αιτιοπαθογενετικών μηχανισμών που διέπουν την εντερική ίνωση, καθώς και η πιθανή ανάδειξη νέων φαρμακολογικών στόχων για τον σχεδιασμό καινοτόμων και αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων για την αντιμετώπιση της εντερικής ίνωσης. Υλικά και Μέθοδοι - Προκειμένου να επιτευχθούν οι παραπάνω στόχοι, τόσο του πρώτου, όσο και του δεύτερου σκέλους, έγινε απομόνωση ΕΥΜ από κολονικές βιοψίες φυσιολογικών μαρτύρων και ασθενών με NC. Επιπλέον, καλλιεργήθηκαν οι κυτταρικές σειρές, ΗΤ-29 και 18CO, οι οποίες είναι κολονικά επιθηλιακά κύτταρα και κολονικοί εμβρυικοί ινοβλάστες, αντίστοιχα. Ως προς το πρώτο σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, αρχικά έγινε διέγερση των ΕΥΜ και των 18CO με IL-1α ή/και tumor necrosis factor α (TNF-α) και μελετήθηκε η mRNA και πρωτεϊνική έκφραση του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3. Κατόπιν, έγινε διέγερση των ΗΤ-29 κυττάρων με IL-1α, TNF-α, και interferon γ (IFN-γ) και καλλιέργεια εντερικών ιστοτεμαχίων από ασθενείς με NC και το υπερκείμενο αυτών, χρησιμοποιήθηκε ως διεγέρτης σε καλλιέργειες ΕΥΜ για τον έλεγχο της mRNA και πρωτεϊνικής έκφρασης του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3. Παράλληλα, μελετήθηκε η mRNA και πρωτεϊνική έκφραση του TL1A και των υποδοχέων του, DR3 και DcR3 σε ΕΥΜ από ασθενείς με NC. Στη συνέχεια, έγινε διέγερση των ΗΤ29 κυττάρων με IL-1α, TNF-α και IFN-γ, προκειμένου να μελετηθεί η mRNA και η πρωτεϊνική έκφραση των υποδοχέων του TL1A, DR3 και DcR3. Τέλος, έγινε διέγερση των ΗΤ29 κυττάρων με TL1A, προκειμένου να μελετηθεί η mRNA έκφραση της IL-8.Ως προς την επίτευξη των στόχων του δεύτερου σκέλους της παρούσας διδακτορικής διατριβής, αρχικά, έγινε διέγερση των ΕΥΜ με IL-1α ή/και TNF-α, καθώς και με Lipopolysaccharide (LPS) προκειμένου να μελετηθεί η βασική και η επαγόμενη από τις προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, mRNA και πρωτεϊνική έκφραση των υποδοχέων των ιντερλευκινών. Στη συνέχεια, ακολούθησε διέγερση των ΕΥΜ με κυτταροκίνες της Th1 (TNF-α ή/και IFN-γ), της Th2 (IL-4 ή/και IL-13), της Th17 (IL-17 ή/και IL-22 ή/και IL-23) και της Treg (IL-10 ή/και transforming growth factor β (TGF-β)) ανοσοαπόκρισης, προκειμένου να μελετηθεί η mRNA έκφραση των προ-ινωτικών παραγόντων, κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ, φιμπρονεκτίνης, α smooth muscle actin (α-SMA), tissue factor (TF), μεταλλοπρωτεϊνάσης-1 (metalloproteinase-1, MMP-1), MMP-9, αναστολέα των μεταλλοπρωτεϊνασών-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1) και ΤΙΜΡ-2 και η πρωτεϊνική έκφραση των προ-ινωτικών παραγόντων, κολλαγόνου και φιμπρονεκτίνης. Τέλος, έγινε διέγερση των ΕΥΜ με κυτταροκίνες της Th1 (TNF-α ή/και IFN-γ), της Th2 (IL-4 ή/και IL-13), της Th17 (IL-17 ή/και IL-22 ή/και IL-23) και της Treg (IL-10 ή/και TGF-β) ανοσοαπόκρισης, προκειμένου να διερευνηθεί η επίδρασή τους στην μεταναστευτική ικανότητα των ΕΥΜ, μέσω της δοκιμασίας επούλωσης τραύματος.Για τις mRNA μελέτες έκφρασης, έγινε απομόνωση ολικού RNA από τα κύτταρα, δημιουργία συμπληρωματικού DNA και μελέτη της έκφρασης με την χρήση της μεθόδου real time rt-PCR. Οι μελέτες πρωτεϊνικής έκφρασης έγιναν είτε με την μέθοδο του ανοσοφθορισμού, είτε με την μέθοδο της ELISA. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του κολλαγόνου μετρήθηκαν με την μέθοδο Sircol. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με Student's t test. Αποτελέσματα - Ως προς το πρώτο σκέλος, η διέγερση των ΕΥΜ και των 18CO κυττάρων με τις προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1α ή/και TNF-α, οι οποίες έχουν βρεθεί αυξημένες στον φλεγμαίνοντα εντερικό βλεννογόνο ασθενών με ΙΦΝΕ, οδήγησε στην αύξηση της mRNA και της πρωτεϊνικής έκφρασης του TL1A. Ιστικά υπερκείμενα από καλλιέργειες βιοψιών ασθενών με NC προκάλεσαν την mRNA και πρωτεϊνική έκφραση του TL1A στους ΕΥΜ. ΕΥΜ από ασθενείς με NC βρέθηκαν θετικοί στην έκφραση του TL1A. Η διέγερση των ΗΤ-29 κυττάρων με IL-1α, TNF-α και IFN-γ οδήγησε στην επαγωγή της έκφρασης του DR3 και τα υπερκείμενα αυτών, προκάλεσαν την mRNA και πρωτεϊνική έκφραση του TL1A στους ΕΥΜ. Η διέγερση των ΗΤ-29 κυττάρων με TL1A οδήγησε στην επαγωγή της mRNA έκφρασης της IL-8.Ως προς το δεύτερο σκέλος, σε ΕΥΜ από φυσιολογικούς μάρτυρες ανιχνεύθηκε μία βασική έκφραση των υποδοχέων ιντερλευκινών (Τh1: IFNGR1, IFNGR2, TNFRSF1A, IL12RB2, IL1R1 και IL1R2, Th2: IL4R και IL13RA2, Th17: IL22RA1, Treg: IL10RA, IL10RB, TGFBR1 και TGFBR2). Η διέγερση των ΕΥΜ με τις προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1α ή/και TNF-α επηρέασε, είτε θετικά, είτε αρνητικά την έκφραση αυτή. Αντίθετα, η διέγερση των ΕΥΜ με LPS δεν προκάλεσε οποιοδήποτε στατιστικώς σημαντικό αποτέλεσμα στην έκφραση των υποδοχέων. Η διέγερση των ΕΥΜ με Th1 κυτταροκίνες είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της έκφρασης του mRNA του TF και της ΜΜP-1, της πρωτεΐνης του κολλαγόνου και της φιμπρονεκτίνης, καθώς και την μείωση της έκφρασης του mRNA της α-SMA και της ΜΜΡ-9 και του ρυθμού μετανάστευσης των ΕΥΜ. Η διέγερση των ΕΥΜ με Th2 κυτταροκίνες προκάλεσε την αύξηση του mRNA του κολλαγόνου, TF, α-SMA, ΜΜΡ-1 και του ρυθμού μετανάστευσης των ΕΥΜ και την μείωση της πρωτεΐνης της φιμπρονεκτίνης και του mRNA της ΜΜΡ-9. Οι Th17 κυτταροκίνες είχαν μεικτή επίδραση στους ΕΥΜ, καθώς οι IL-17 και IL-23 προκάλεσαν την αύξηση της φιμπρονεκτίνης, ενώ η IL-22, την μείωσή της και την ελάττωση της παραγωγής του TF. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα στην μεταναστευτική ικανότητα των μυοϊνοβλαστών: οι IL-17 και IL-22 προκάλεσαν την μείωση του ρυθμού μετανάστευσης, ενώ η IL-23, το αντίθετο. Επιπλέον, η IL-23 προκάλεσε την αύξηση της έκφρασης τόσο της MMP-1, όσο και της ΤΙΜΡ-1. Τέλος, ως αναμένετο, ο TGF-β αποδείχθηκε ως ο πιο αποτελεσματικός προ-ινωτικός παράγοντας, καθώς προκάλεσε την αύξηση όλων των υπό μελέτη προ-ινωτικών μορίων, καθώς και του ρυθμού μετανάστευσης των ΕΥΜ. Συμπεράσματα - Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναδεικνύεται πως οι ΕΥΜ εμπλέκονται άμεσα στην εντερική φλεγμονή και πως οι ανοσολογικές αποκρίσεις της έμφυτης και της ειδικής ανοσίας διαδραματίζουν ενεργό ρόλο στην ανάπτυξη εντερικής ίνωσης. Επιπλέον, η παρούσα διδακτορική διατριβή αναδεικνύει νέους πιθανούς θεραπευτικούς στόχους, η μελέτη των οποίων, ίσως, να οδηγήσει στην ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών για την αντιμετώπιση της εντερικής ίνωσης.