Η αλληλεπίδραση λεμφοκυττάρων και κολονικών επιθηλιακών κυττάρων στην φλεγμονώδη εντεροπάθεια: ο ρόλος των χημειοκινών

Abstract

Human colonic epithelial cells express Th1-associated chemoattractants, yet little is known about the production of Th2-associated chemoattractants. Furthermore, T-lymphocyte migration is implicated in the pathogenesis of Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). CXC chemokines MIG, IP-10, and I-TAC act by binding to the CXCR3A or the splice variant CXCR3B receptor on Th1-lymphocytes. On the other hand, CC chemokines, CCL11/Eotaxin-1, CCL24/Eotaxin-2, and CCL26/Eotaxin-3 are known to attract CCR3-expressing, Th2-polarized lymphocytes. We investigated the role of these CXC and CC chemokines and their receptors in patients with UC, CD, and normal controls (NC). Methods We studied constitutive and inflammation-induced expression and production of CXCR3 and CCR3 together with their ligands in the colon and CD3+ peripheral blood lymphocytes of patients with inflammatory bowel diseases (IBD) by flow cytometry, reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). We further defined the regulated expression of these chemokines by RT-PCR and ELISA using cultured human epithelial cell lines. Thus, HT-29 and Caco-2 colonic epithelial cells were studied following in vitro stimulation with pro-inflammatory (Th1) and Th2-derived cytokines. Results CXCR3A mRNA (full size) expression was found in CD3+ PBL from normal controls and UC patients, but not from CD patients. In contrast, CD3+ PBL from CD patients showed a marked mRNA expression of the spliced variant CXCR3B. This finding could explain the high expression of CXCR3 on CD3+ PBL from CD patients in flow cytometry. Increased chemokines expression and production was found in colonic biopsies and serum from CD compared to UC patients and normal controls. Stimulation of epithelial cells with Th1 proinflammatory cytokines significantly induced chemokines production. The addition of Th2-derived cytokines had an inhibitory effect. Stimulation of Jurkat cells with cytokines and supernatant conditioned media from epithelial cells induced CXCR3A or CXCR3B expression depending on the stimuli. When CC chemokines were examined, a higher fraction of peripheral T lymphocytes were found to be positive for CCR3 in patients with ulcerative colitis (UC) compared to Crohn’s Disease (CD) whilst almost no CCR3+ T cells were found in normal controls (NC). Similarly, higher and more frequent expression of CCR3 was observed in colonic biopsies from patients with UC-regardless of the disease activity-when compared to CD or NCs. Serum CCL11/Eotaxin-1 was significantly increased in UC (306±87pg/ml) and less so in CD (257±43pg/ml) whereas CCL24/Eotaxin-2, and CCL26/Eotaxin-3 were increased only in UC. Colonic expression of the three chemokines was minimal in NCs but high in IBD (especially UC) and was independent of disease activity. Th2 and to a lesser extent Th1 cytokines were able to induce expression and production of all three eotaxins from colonic epithelial cells in culture. Conclusions These data demonstrate that PBL from CD patients express a spliced variant of the CXCR3 receptor and suggests that epithelium can play a role in modulating pathologic T cell–mediated mucosal inflammation. Furthermore CCR3 and ligands over-expression would appear to be a characteristic of UC. The production of CCR3 ligands by human colonic epithelial cells further supports the important role of epithelium – lymphocyte interaction in the pathogenesis of IBD

Τα κολονικά επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου εκφράζουν χημειοκίνες σχετιζόμενες με την Th1 ανοσολογική απόκριση. Ωστόσο λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο των επιθηλιακών κυττάρων στην Th2 ανοσολογική αντίδραση. Επιπλέον η μετανάστευση των Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία εκφράζουν στην επιφάνειά τους υποδοχείς χημειοκινών, προς το κολονικό επιθήλιο εμπλέκεται στην αιτιοπαθογένεια της Crohn και Ελκώδους Κολίτιδας. Μελετήσαμε την έκφραση των CXC χημειοκινών MIG, IP-10, και I-TAC οι οποίες προσδένονται στον CXCR3A υποδοχέα των Th1 κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων ή στο μεταγραφικό του αλλήλιο CXCR3B αλλά και των CC χημειοκινών, CCL11/Eotaxin-1, CCL24/Eotaxin-2, και CCL26/Eotaxin-3 οι οποίες προσδένονται στον CCR3 υποδοχέα των Τh2 κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με Νόσο Crohn, Ελκώδη Κολίτιδα και σε υγιείς μάρτυρες. Αποτελέσματα Tα mRNA των τριών CXCR3 συνδεόμενων χημειοκινών (MIG, IP-10 και ITAC) ανευρίσκονται αυξημένα σε βιοψίες παχέος εντέρου ασθενών με Νόσο Crohn (CD). Παρομοίως ανευρίσκονται αυξημένα τα επίπεδα των MIG και ITAC χημειοκινών στον ορό των ασθενών με Νόσο Crohn και λιγότερο με Ελκώδη Κολίτιδα σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. In vitro πειράματα σε κολονικά επιθηλιακά κύτταρα έδειξαν επαγωγή της έκφρασης mRNA και της παραγωγής των τριών χημειοκινών MIG, IP-10 και I-TAC και στις δύο κυτταρικές σειρές μετά από επίδραση Th1 κυτταροκινών. Επίδραση των Τh2 αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-4, IL-10, IL-13) στην επαγόμενη από τις Th1 κυτταροκίνες (IL-1α, TNF-α και IFN-γ) έκφραση των τριών CXCR3 συνδεόμενων χημειοκινών είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της έκφρασης και παραγωγής των χημειοκινών αυτών και στις δύο επιθηλιακές κυτταρικές σειρές. Ο υποδοχέας των χημειοκινών αυτών, CXCR3 ανιχνεύτηκε σημαντικά αυξημένος με κυτταρομετρία ροής σε CD3+ ανοσομαγνητικά διαχωρισθέντα περιφερικά λεμφοκύτταρα ασθενών με Νόσο Crohn και λιγότερο με Ελκώδη Κολίτιδα σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Σε ανοσομαγνητικά διαχωρισθέντα CD3+ περιφερικά λεμφοκύτταρα από ασθενείς με Νόσο Crohn παρατηρήθηκε κυρίως έκφραση mRNA του μεταγραφικού αλληλίου CXCR3Β υποδοχέα, Αντίθετα υγιείς μάρτυρες εξέφραζαν κυρίως το mRNA του CXCR3Α ενώ στην Ελκώδη Κολίτιδα παρατηρήθηκε παρόμοια έκφραση CXCR3Α και CXCR3Β. In vitro επιδράσεις στη λευχαιμική κυτταρική σειρά Jurkat έδειξαν επαγωγή των CXCR3Α και CXCR3Β mRNAs μετά από επίδραση με IFN-γ, ενώ η IL-1α προκαλούσε επαγωγή μόνο του CXCR3Β mRNA. Επίδραση TNF-α είχε ως αποτέλεσμα επαγωγή του CXCR3Α. Όσον αφορά τις CC χημειοκίνες, σε βιοψίες παχέoς εντέρου παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του mRNA και των τριών CCR3 συνδεόμενων χημειοκινών – CCL11 (eotaxin), CCL24 (eotaxin 2) και CCL26 (eotaxin 3) - σε ιστούς ασθενών με Ελκώδη Κολίτιδα σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες και ασθενείς με Νόσο Crohn. Συνολικά και οι τρεις χημειοκίνες που συνδέονται στον CCR3 υποδοχέα βρέθηκαν αυξημένες στον ορό ασθενών με Ελκώδη Κολίτιδα. Κατόπιν μελετήσαμε in vitro στις HT-29 και Caco-2 κυτταρικές σειρές την έκφραση mRNA και την παραγωγή των χημειοκινών αυτών μετά από επίδραση κυτταροκινών. Επίδραση του συνδυασμού των Th1 κυτταροκινών είχε ως αποτέλεσμα αύξηση του mRNA της CCL26/Eotaxin-3 και στις δύο κυτταρικές σειρές καθώς και των χημειοκινών CCL11/Eotaxin-1 και CCL24/Eotaxin-2 σε μικρότερο βαθμό. Επίδραση με το συνδυασμό των προφλεγμωνωδών κυτταροκινών Th2 προκάλεσε σημαντική επαγωγή mRNA και των τριών χημειοκινών, CCL11/Eotaxin-1 και στις δύο κυτταρικές σειρές. Αλλά και σε επίπεδο πρωτεΐνης, οι Th2 προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες σε συνδυασμό επάγουν την παραγωγή των CCR3 συνδεόμενων χημειοκινών και στις δύο κολονικές επιθηλιακές κυτταροσειρές. Όσον αφορά τον υποδοχέα των χημειοκινών αυτών CCR3, η έκφραση του mRNA ήταν μέγιστη σε βιοψίες κολονικού βλεννογόνου ασθενών με Ελκώδη Κολίτιδα (95%), σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες (20%). Έκφραση παρατηρήθηκε και στο 65% των ασθενών με Νόσο Crohn. Η έκφραση αυτή παρουσιάζονταν ανεξάρτητα από την ενεργότητα της νόσου και το βαθμό φλεγμονής του κολονικού βλεννογόνου. Η κυτταρομετρία ροής σε ανοσομαγνητικά διαχωρισθέντα CD3+ κύτταρα ανέδειξε έκφραση του υποδοχέα CCR3 κυρίως σε ασθενείς με Ελκώδη Κολίτιδα, λιγότερο σε Νόσο Crohn και σχεδόν καθόλου σε υγιείς μάρτυρες. Συμπεράσματα Στη μελέτη μας παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του CXCR3 υποδοχέα σε ανοσομαγνητικά διαχωρισθέντα CD3+ λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος από ασθενείς με Νόσο Crohn και Ελκώδη Κολίτιδα σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες. Αυτή η έκφραση ήταν υψηλότερη στους ασθενείς με Νόσο Crohn οι οποίοι εξέφραζαν το mRNA του μεταγραφικού αλληλίου CXCR3B. Επιπρόσθετα, η έκφραση των CCR3 συνδεόμενων