Περίληψη
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιήθηκε η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών σφαιριδίων στη μοριακή διάγνωση της μικρομεταστατικής νόσου στον καρκίνο του μαστού. Η ανάπτυξη και η αξιολόγηση της μεθοδολογίας βασίσθηκε στην μελέτη της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων σε κυκλοφορούντα στο περιφερικό αίμα καρκινικά κύτταρα που με βάση τα πολύ πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα συσχετίζονται άμεσα με το μεταστατικό δυναμικό το όγκου. Μέχρι στιγμής δεν έχει δημοσιευθεί καμία εργασία στο συγκεκριμένο θέμα στη διεθνή βιβλιογραφία. Αξιοποιώντας την υπάρχουσα υποδομή και τεχνογνωσία των εργαστηρίων μας, αναπτύχθηκε μία αναλυτική μεθοδολογία για την ταυτόχρονη μελέτη 6 γονιδίων (CK-19, HER-2, MAGE-A3, hMAM, TWIST-1, PBGD) με βάση τις υγρές μικροσυστοιχίες. Η μέθοδος αυτή είναι απλή και αξιόπιστη, κατάλληλη για εφαρμογή σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων ενώ υπάρχει δυνατότητα επέκτασης της μεθόδου για μελέτης της έκφρασης έως και 100 γονιδίων ταυτόχρονα. Για την αναπτυχθείσα μέθοδο πραγματοποιήθηκαν πειρά ...
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αξιοποιήθηκε η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών σφαιριδίων στη μοριακή διάγνωση της μικρομεταστατικής νόσου στον καρκίνο του μαστού. Η ανάπτυξη και η αξιολόγηση της μεθοδολογίας βασίσθηκε στην μελέτη της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων σε κυκλοφορούντα στο περιφερικό αίμα καρκινικά κύτταρα που με βάση τα πολύ πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα συσχετίζονται άμεσα με το μεταστατικό δυναμικό το όγκου. Μέχρι στιγμής δεν έχει δημοσιευθεί καμία εργασία στο συγκεκριμένο θέμα στη διεθνή βιβλιογραφία. Αξιοποιώντας την υπάρχουσα υποδομή και τεχνογνωσία των εργαστηρίων μας, αναπτύχθηκε μία αναλυτική μεθοδολογία για την ταυτόχρονη μελέτη 6 γονιδίων (CK-19, HER-2, MAGE-A3, hMAM, TWIST-1, PBGD) με βάση τις υγρές μικροσυστοιχίες. Η μέθοδος αυτή είναι απλή και αξιόπιστη, κατάλληλη για εφαρμογή σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων ενώ υπάρχει δυνατότητα επέκτασης της μεθόδου για μελέτης της έκφρασης έως και 100 γονιδίων ταυτόχρονα. Για την αναπτυχθείσα μέθοδο πραγματοποιήθηκαν πειράματα βελτιστοποίησης σε όλα τα στάδια του πρωτοκόλλου ώστε να λαμβάνεται το βέλτιστο σήμα και να διασφαλιστεί η εγκυρότητα και η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων. Ακολούθως, εφαρμόστηκε η μεθοδολογία αυτή για τη μοριακή διάγνωση της μικρομεταστατικής νόσου μέσω προσδιορισμού κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα σε ειδικά επιλεγμένη ομάδα ασθενών, αξιοποιώντας το ήδη διαθέσιμο και πολύ καλά μελετημένο κλινικό υλικό της ομάδας μας. Η προσέγγιση αυτή θα επιτρέψει την ευρύτερη εφαρμογή των μικροσυστοιχιών στη μελέτη του καρκίνου του μαστού, και θα δώσει τη δυνατότητα εξαγωγής σημαντικών συμπερασμάτων ως προς την πιθανότητα πρόβλεψης της πορείας της νόσου από τα αρχικά της στάδια μέσω της έγκαιρης μοριακής διάγνωσης της μικρομεταστατικής νόσου, με κύρια συνέπεια την ιδιαίτερη αξιολόγηση για κάθε ασθενή επιλογής της θεραπευτικής αντιμετώπισης. Από την εφαρμογή της μεθόδου στα κλινικά δείγματα προέκυψε ότι ανιχνεύτηκε τουλάχιστον ένα γονίδιο στο 57.8% των ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού προ επικουρικής χημειοθεραπείας και παρόλα που τα ποσοστά ανίχνευσης ήταν μειωμένα σε σχέση με την ομάδα των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού εντούτοις υπήρχαν και 2 δείγματα στα οποία ανιχνεύτηκαν και τα 6 γονίδια (3.1%). Η ανάπτυξη μεθοδολογίας με βάση το σύστημα των ηλεκτρονικών μικροσυστοιχιών αν και επιχειρήθηκε διεξοδικά και με πολλές διαφορετικές προσεγγίσεις, εντούτοις δεν οδήγησε σε θετικά αποτελέσματα λόγω ανυπέρβλητων τεχνικών δυσκολιών και εξαιρετικά υψηλού κόστους των αναλωσίμων. Επιπλέον το σύστημα αυτό δεν είχε την απαραίτητη ευαισθησία για να εφαρμοστεί σε επίπεδο RNA στα CTCs, έστω και μετά την γραμμική ενίσχυση του mRNA, αλλά ακόμα και έπειτα από την εκθετική ενίσχυση με PCR δεν αντιμετωπίστηκε το πρόβλημα αυτό. Τέλος, μελετήσαμε για πρώτη φορά την έκφραση των ώριμων miRNAs στα CTCs ασθενών με καρκίνο του μαστού. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκε μεθοδολογία real-time RT-PCR για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ώριμου let-7a, miR-21 και miR-10b χωριστά και εφαρμόστηκε η αναπτυχθείσα μέθοδος σε δείγματα ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Με βάση τα πειραματικά μας αποτελέσματα βρέθηκε ότι το επίπεδο έκφρασης του miR-21 ήταν το ίδιο για όλα τα δείγματα στο κλάσμα των CTC και δεν υπήρχε καμία διαφοροποίηση στην τιμή των Cq μεταξύ των φυσιολογικών δειγμάτων και των δειγμάτων που προέρχονται από ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Η έκφραση του ώριμου το miR-10b δεν ανιχνεύτηκε σε κανένα από τα εξεταζόμενα δείγματα παρόλο που το θετικό δείγμα ελέγχου επιβεβαίωνε πάντα την σωστή πορεία της μεθόδου. Αντίθετα, παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση του ώριμου let-7a στο κλάσμα των CTCs των υγιών αιμοδοτών ενώ στο αντίστοιχο κλάσμα των δειγμάτων από ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του μαστού η έκφραση του ανιχνεύτηκε σε 10 από τα 20 δείγματα (50 %)
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
The aim of our study was to develop and validate a multiplexed PCR-coupled liquid bead array to detect the expression of multiple genes in Circulating Tumor Cells (CTCs), and application of this assay in peripheral blood samples of breast cancer patients. We report for the first time on the expression of mature let-7a and miR-21 in CTCs of breast cancer patients. We also examine the correlation between CK-19 expression and the expression of these miRNAs in CTCs. We designed a novel multiplexed PCR-coupled liquid bead array that consist of the following steps: a) in silico designed gene-specific primers and capture probes for CK-19, HER-2, Mammaglobin (hMAM), MAGE-A3, TWIST-1 and PBGD (as a control gene), b) RNA isolation from immunomagnetically enriched CTCs, c) multiplex PCR, d) sequence hybridization array, e) detection in the Luminex platform. We performed extensive optimization experiments using the SKBR3 and MDA-MB-231 cell lines as positive controls, to maximize analytical sensit ...
The aim of our study was to develop and validate a multiplexed PCR-coupled liquid bead array to detect the expression of multiple genes in Circulating Tumor Cells (CTCs), and application of this assay in peripheral blood samples of breast cancer patients. We report for the first time on the expression of mature let-7a and miR-21 in CTCs of breast cancer patients. We also examine the correlation between CK-19 expression and the expression of these miRNAs in CTCs. We designed a novel multiplexed PCR-coupled liquid bead array that consist of the following steps: a) in silico designed gene-specific primers and capture probes for CK-19, HER-2, Mammaglobin (hMAM), MAGE-A3, TWIST-1 and PBGD (as a control gene), b) RNA isolation from immunomagnetically enriched CTCs, c) multiplex PCR, d) sequence hybridization array, e) detection in the Luminex platform. We performed extensive optimization experiments using the SKBR3 and MDA-MB-231 cell lines as positive controls, to maximize analytical sensitivity and specificity and we further validated the performance of this array in respect to cross reactivity and intra and inter-precision. Finally, we applied the developed methodology in peripheral blood samples of 72 patients with operable breast cancer, 25 patients with verified metastasis and 17 healthy individuals. Highly specific amplification and quantification of mature miR-21 and mature let-7a was achieved by looped real time RT-PCR. CK-19 mRNA expression was also quantified in both fractions by quantitative real-time PCR to the patients with verified metastasis and to the healthy individuals. The analytical performance of the developed array was evaluated in tumor cell lines in respect to analytical sensitivity and specificity. Cross reaction studies were performed for each gene target in the presence of all other targets. The assay is highly specific for each gene in complex multiplexed formats, since the discriminatory power of fluorescent bead sets is unique to specifically detect by sequence hybridization the presence of individual gene specific PCR products. The developed liquid bead-based array is highly sensitive, since it can detect the expression of each individual gene at one SKBR3 cell level. The validation of the array included within day and between-days precision studies. None of the genes tested was detected in the CTC fraction of healthy donors while in patients with verified metastasis, CK-19 was detected in 48%, HER-2 in 20%, MAGE-A3 in 24%, hMAM in 16% and TWIST-1 in 20%. In operable breast cancer patients, CK-19 was detected in 27.8%, HER-2 in 12.6%, TWIST-1 in 20.2%, MAGE-A3 in 34.2% while hMAM was detected in 8.9%. Our results show that individual gene expression can be readily measured in CTCs using a bead-based platform. This may form an efficient basis for a multiplex approach to measure multiple genes ( up to 100) in the same sample, thus saving sample volume and reducing the total cost and time of analysis. This is the first time that the Luminex technology is used for gene expression studies in CTCs. Regarding the expression of mature miRNAs the expression of miR-21 in the CTCs fraction was similar in samples from healthy donors compared to patients with verified breast cancer metastasis. On the other hand, let-7a was expressed in the CTC fraction of all healthy donors while in 10/22 (45.5%) patients samples with verified metastasis, let-7a expression was not at all detected in the CTCs fraction. Remarkably, in 9 out of these 10 samples (90%) in which the let-7a expression was totally absent, we detected positive expression of CK-19. Reversely, only 3 out of 12 (25%) remaining samples, in which let-7a was expressed, were positive for CK-19.
περισσότερα