Μελέτη του γονιδίου της ακετυλεστεράσης του σιαλικού οξείος (SIAE) σε ασθενείς με κοινή ποικίλη ανοσοανεπάρκεια και εκλεκτική IgA ανεπάρκεια

Abstract

Introduction: Sialic acid acetylesterase (SIAE) is involved in the regulation of BCR signaling, contributing to the maintenance of immunological tolerance. Recently, it has been reported that mutations in the SIAE gene predispose to a number of relative common human autoimmune diseases, including rheumatoid arthritis, diabetes mellitus type I, systemic lupus erythematosus and multiple sclerosis. Considering that patients with common variable immunodeficiency (CVID) and selective IgA deficiency (sIgAD) and/or their relatives display a predisposition to autoimmunity, the aim of this study was to investigate the mutational status of SIAE and its possible contribution in the autoimmune disease risk in families and individuals with CVID and sIgAD. Materials and mehods: Forty (40) patients (male/female: 14/26, mean age 29.2 years, and range: 2-85 years) were enrolled. Among them, 26 patients suffered from IgA deficiency. Twelve (12) of those 26 patients displayed autoimmune manifestations (lupus, diabetes mellitus I, celiac disease, juvenile rheumatoid arthritis, autoimmune thyroiditis, Raynaud’s syndrome, idiopathic thrombocytopenic purpura). In addition, 5 families were studied, [6 patients with CVID and 8 relatives], some of which had a medical history of autoimmune diseases (lupus, rheumatoid arthritis, recurrent ITP, juvenile rheumatoid arthritis). Genomic DNA was extracted from whole blood using QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen,UK) according to the instructions of the manufacturer. For all samples, all 10 exons of the SIAE gene were amplified including the exon-intron boundaries using conventional PCR. The next step was to purify the PCR products by the use of the Qiagen PCR purification system (Qiagen). Direct sequencing of the purified PCR products then took place, using an ABI prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) and a BigDye Terminator DNA sequencing kit of the same company. Results: No patient with CVID (displaying autoimmunity or not) was found to have a SIAE exon mutation. However, an 11 year old patient with sIgAD diagnosed during a respiratory infection and the mother of a CVID patient who suffered from lupus were heterozygous for the M89V mutation (g.20536A>G, rs78778622, exon 3 mutation.) In addition, a novel silent mutation was found in an IgAD patient in exon 4 (g.26532T>C, c.427T>C, L143L). Also, in a patient with sIgA deficiency 2 silent mutations were found, specifically the silent mutation S156S (g.26573T>C, rs1942663, exon 4) and T484T (g.44233G>A, rs7941327, exon 10.) Furthermore, as expected, a number of intronic SNPs were identified. These were the intronic alterations g.11964G>A (rs512225, intron 2), g.31722C>T (rs790300393, intron5), g.41675A>G (rs620499, intron 8) and g.42499C>T (rs77343428, intron 8).Conclusion: The results of this study indicate that SIAE mutations are not associated with autoimmune risk in patients with CVID and sIgAD deficiency. However, a larger number of CVID samples and sIgAD samples are required to be analyzed in order to draw a conclusion of more certainty.

Εισαγωγή: H ακετυλεστεράση του σιαλικού οξέος (SIAE) εμπλέκεται στη ρύθμιση της BCR σηματοδότησης, συμβάλλοντας έτσι στη διατήρηση της ανοσιακής ανοχής. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι μεταλλάξεις στο γονίδιο της SIAE προδιαθέτουν για μια σειρά από σχετικά κοινά ανθρώπινα αυτοάνοσα νοσήματα, συμπεριλαμβανομένης της ρευματοειδούς αρθρίτιδας, του σακχαρώδη διαβήτη τύπου Ι, του συστηματικού ερυθηματώδη λύκου και της πολλαπλής σκλήρυνσης. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι ασθενείς με κοινή ποικίλη ανοσοανεπάρκεια (CVID) και εκλεκτική ανεπάρκεια της IgA (sIgAD) και/ή οι συγγενείς τους, εμφανίζουν μία προδιάθεση για αυτοανοσία, ο σκοπός αυτής της διατριβής είναι η μελέτη και διερεύνηση των μεταλλάξεων της SIAE και η πιθανή συμβολή τους στη προδιάθεση αυτοάνοσων ασθενειών σε οικογένειες και άτομα με CVID και sIgAD.Υλικά και Μέθοδοι: Σαράντα (40) ασθενείς (άνδρες/γυναίκες: 14/26, μέση ηλικία 29,2 χρόνια, με εύρος: 2-85 έτη) συμμετείχαν στη μελέτη. Μεταξύ αυτών, 26 ασθενείς έπασχαν από εκλεκτική ανεπάρκεια της IgA. Δώδεκα (12) από τους 26 ασθενείς εμφάνιζαν αυτοάνοσες εκδηλώσεις όπως (συστημικό ερυθηματώδη λύκο, σακχαρώδη διαβήτη τύπου Ι, κοιλιοκάκη, νεανική ρευματοειδή αρθρίτιδα, αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα, ιδιοπαθής θρομβοπενική πορφύρα). Επιπροσθέτως, μελετήθηκαν 5 οικογένειες [6 ασθενείς με CVID και 8 συγγενείς τους] κάποιοι εκ των οποίων είχαν ιστορικό αυτοάνοσων ασθενειών όπως (συστηματικού ερυθηματώδη λύκου, ρευματοειδούς αρθρίτιδας, υποτροπιάζουσας ιδιοπαθούς θρομβοπενικής πορφύρας και νεανικής ρευματοειδούς αρθρίτιδας). Γενωμικό DNA απομονώθηκε από περιφερικό αίμα με τη χρήση του QIAamp DNA mini kit της Qiagen, σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρείας. Για όλα τα δείγματα και τα δέκα εξώνια του γονιδίου SIAE ενισχύθηκαν συμπεριλαμβανομένων των ορίων εξονίων-ιντρονίων κάνοντας χρήση συμβατικών PCR. Το επόμενο βήμα ήταν να γίνει καθαρισμός των προϊόντων της PCR με τη χρήση συστήματος Qiagen PCR. Αυτόματος προσδιορισμός ακολουθίας DNA πραγματοποιήθηκε με τον αναλυτή ABI PRISM 310 Genetic Analyzer της Applied Biosystems, χρησιμοποιώντας το kit BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing της ίδιας εταιρείας. Αποτελέσματα: Κανείς ασθενής με CVID (με εμφάνιση αυτοάνοσων συμπτωμάτων ή όχι) βρέθηκε να έχει κάποια μετάλλαξη σε εξόνιο της SIAE. Ωστόσο, μία ασθενής 11 χρόνων που διαγνώστηκε με sIgAD κατά τη διάρκεια μίας λοίμωξης του αναπνευστικού όπως επίσης και η μητέρα μίας ασθενούς με CVID βρέθηκαν να είναι ετεροζυγώτες για τη μετάλλαξη Μ89V (g.20536A>G, rs78778622, εξόνιο 3). Επιπροσθέτως, μία novel σιωπηλή μετάλλαξη βρέθηκε σε ένα ασθενή με sIgAD στο εξόνιο 4 (g.26532T>C, c.427T>C, L143L). Επίσης, σε ένα ασθενή με sIgAD, 2 σιωπηλές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν, συγκεκριμένα η σιωπηλή μετάλλαξη S156S (g.26573T>C, rs1942663, εξόνιο 4) και η T484T (g.44233G>A, rs7941327, εξόνιο 10). Όπως ήταν αναμενόμενο, αρκετές γνωστές μεταλλάξεις εσονίων βρέθηκαν στα δείγματα. Αυτές είναι οι g.11964G>A (rs512225, εσόνιο 2), g.31722C>T (rs79300393, εσόνιο 5), g.42499C>T (rs 77343428, εσόνιο 8) και g.41675A>G (rs620499, εσόνιο 8). Συμπεράσματα: Από τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι μεταλλάξεις της SIAE δεν σχετίζονται με κίνδυνο αυτοάνοσων ασθενειών, σε ασθενείς με CVID ή sIgAD. Ωστόσο, ένας μεγαλύτερος αριθμός δειγμάτων CVID και sIgAD απαιτείται για ανάλυση, προκειμένου να έχουμε πιο ασφαλή συμπεράσματα.