Κυκλικά διπεπτίδια σε τρόφιμα και ποτά: σύνθεση, αναλυτικός προσδιορισμός και ταυτοποίηση μοριακών ειδών

Abstract

Diketopiperazines (DKPs) are cyclic dipeptides which have been detected in a variety of natural products, especially in thermally treated or fermented foods and beverages, providing a metallic bitter taste. DKPs, mainly due to their characteristic heterocyclic system, have been reported to exhibit a broad spectrum of biological activities including antimicrobial, antiviral, antitumor, antihyperglycaemic and antimutagenic. The purpose of this study was to develop a liquid chromatography method for separation and identification of DKPs in complex matrices (i.e. food and beverages) as well as a high resolution mass spectrometry method providing accurate full scan MS and MSn data in order to investigate the fragmentation pattern and confirm the chemical formula and structure of DKPs containing aromatic amino acids. Our results which were supported by in silico DFT energy calculations, revealed different and common fragmentation pathways as well as a series of characteristic fragment ions which are representative of the amino acid residues. The role of MSn was signified by the results since it provided a clear picture of the fragmentation cascades. The obtained fragments are diagnostic and could be used to distinguish cyclic dipeptides in different matrices. In the present study, several DKPs were identified in seven different Greek varieties of processed olives using HR-LC-MSn. The identification of DKPs in olive samples was achieved by comparison of their retention time and fragmentation pattern with reference DKP standards. The MSn spectra were identical to confirm the presence of specific compounds because their results associate both fragmentation pattern and fragments’ intensity. Nine compounds were found out of a total of 19 standard DKPs. The most prominent diketopiperazine was the cyclo(Phe-Phe) followed by and cyclo(Phe-Pro). Furthermore, four cyclic dipeptides, 2.5-diketopiperazines (DKPs) were found in fifteen bottled wines produced from different grape varieties. These compounds were detected for the first time in wine, and their chemical identification was achieved through comparison of their physical and chemical data with that obtained through chemical synthesis.

Οι 2,5-δικετοπιπεραζίνες (DKPs) είναι κυκλικά διπεπτίδια τα οποία έχουν ανιχνευθεί σε μία ποικιλία φυσικών προϊόντων, ιδίως σε θερμικώς επεξεργασμένα ή ζυμωμένα τρόφιμα και ποτά, παρέχοντας μια μεταλλική πικρή γεύση. Οι DKPS επιδεικνύουν ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δράσεων, που πιθανόν οφείλονται στη μοριακή τους δομή, όπως αντιμικροβιακή, αντιική, αντιοξειδωτική, αντιυπεργλυκαιμική και αντιμεταλλαξιγόνο. Ο σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν να αναπτυχθεί μεθοδολογία εκχύλισης των 2,5-δικετοπιπεραζινών από επεξεργασμένα τρόφιμα (ελιές, οίνος) όπως και να αναπτυχθούν μέθοδοι υγρής και αέριας χρωματογραφίας συγκριτικά, για το διαχωρισμό και την ταυτοποίηση των DKPS σε τρόφιμα και ποτά. Επίσης να αναπτυχθεί μέθοδος φασματομετρίας μάζας υψηλής ανάλυσης η οποία μέσω του μηχανισμού θραυσμάτωσης των 2,5-δικετοπιπεραζινών να ταυτοποιεί τον χημικό τύπο τους. Από τα αποτελέσματα της μελέτης τα οποία επιβεβαιώθηκαν με in silico υπολογισμούς ενέργειας DFT, εξηγήθηκε ο μηχανισμός θραυσμάτωσης των προτύπων DKPs από τη μελέτη των θραυσμάτων και της σχετικής αφθονίας τους, όπως προέκυψαν από τα φάσματα μάζας MSn. Από την καταγραφή των χαρακτηριστικών ιόντων που αναμένονται για τις επιμέρους DKPs σε σχέση με τη δομή τους (αρωματική ή αλειφατική αλυσίδα, ύπαρξη συμμετρίας), δημιουργήθηκε ένα διαγνωστικό εργαλείο για την ανίχνευσή τους σε οποιοδήποτε υπόστρωμα. Ανιχνεύτηκαν οκτώ διαφορετικές DKPs σε επτά ελληνικές ποικιλίες επεξεργασμένων ελιών χρησιμοποιώντας HR-LC-MSn. Από τη συγκριτική μελέτη των χρωματογραφημάτων δειγμάτων ελιάς και προτύπων εντοπίσθηκαν συγκεκριμένες μοριακές πιθανές δομές DKPs στις ποικιλίες των ελιών. Οι δομές αυτές επαληθεύθηκαν από την ανάγνωση των φασμάτων μάζας MSn των ενώσεων αυτών. Οι πιο σημαντικές 2,5-δικετοπιπεραζίνες που ανιχνεύθηκαν σε όλα σχεδόν τα μελετούμενα δείγματα ήταν η cyclo(Phe-Phe) και η cyclo(Phe-Pro), οπότε θα μπορούσαν να θεωρηθούν χαρακτηριστικά μοριακά είδη των επεξεργασμένων ελιών. Επίσης τέσσερις 2,5-δικετοπιπεραζίνες ανιχνεύτηκαν σε δεκαπέντε εμφιαλωμένους οίνους που παράγονται από διαφορετικές ποικιλίες σταφυλιών. Η ταυτοποίησή τους επιτεύχθηκε μέσω της σύγκρισης της χρωματογραφικής τους συμπεριφοράς και της δομής τους με συνθετικές ενώσεις.