Επιλογή και βιοχημική (ισοενζυμική) ανάλυση υψηλοαποδοτικών για ρητίνη γενοτύπων χαλεπίου πεύκης (Pinus halepensis Mill.): ποιοτική και ποσοτική ανάλυση της ρητίνης

Abstract

Oleoresin is a forestry product of special economic value. Its components are very important for industrial use. Oleoresin is produced by various coniferous trees around the world. In Greece, Allepo, Brutia and Black pine have been occasionally tapped, with Allepo pine being the most productive of the three species. Oleoresin yield varies widely among Allepo pine (Pinus halepensis) trees. While the average yield of Greek Aleppo pine is 2.7 kg/year, there are individuals yielding more than 12 kg/year. The primary aim of the present study was to locate high yielding oleoresin trees in the areas of Cassandra (Chalkidiki) and Kirunthos (Euboia). In Chalkidiki 22 plus trees with average yield of about 18kg/year were located, whereas in Euboia 11 plus trees were located yielding 24kg/year. Moreover, in each region individuals yielding less than 2kg/year were located (control trees). From the selected trees, oleoresin and cones were sampled in order to analyse the qualitative and quantitative composition of oleoresin and to identify the selected trees with isozyme markers. A GC-MS (Gas Chromatograph – Mass Spectrometer) was used for the qualitative and quantitative analysis of the oleoresin. All together 40 compounds were identified: 11 (35.12%) monoterpenes, 12 (1.40%) sesquiterpenes and 17 (63.50%) diterpenes. The main compounds are the following diterpenes, methyl abietate & abietic acid (39.06%), palustric acid (9.47%), isopimaric acid (5.64%), neoabietic acid (5.14%) and the monoterpene α-pinene (32.93%). The non-parametric Mann-Whitney test, was performed to test for differences between the mean concentration of the compounds, indicated that 10 compounds differentiate plus from control trees, whereas 14 compounds differentiate Chalkidiki from Euboia trees. The step-wise discriminant analysis was also carried out for the same data and three compounds (γ-terpinene, cyclohexanecarboxylic acid and dehydroabietic acid) were found to classify trees according to their grouping (plus and control trees in Chalkidiki and Euboia). The total correct classification result was 72.5%. Moreover, 47 significant correlations (r>0.80) among 21 compounds were found. Most of them were found among 12 sesquiterpenes. Isozyme analysis of endosperms was carried out using starch gel electrophoresis. Thirteen enzyme systems were tested. Eleven of them gave clear resolution results with 17 gene loci, 13 of which were polymorphic (P=73.53%). Totally, 33 alleles were found, the mean allele number was A= 1.853 and the mean effective number was #e= 1.395. The mean observed heterozygosity (H o) was 0.255, the mean expected heterozygosity ( H e) was 0.244, the genetic variability (DST) between the two populations was 0.012 and GST was 0.041. The selected trees were successfully identified with isozymes. From a total of 49 trees, 49 different genotypes were found using 13 polymorphic gene loci. Statistical significant differences in the frequencies of four gene loci (IDH-B, LAP, β-EST και ACP-B) were found between the two populations, Chalkidiki and Euboia. Moreover, allele β-EST-1 was found at a very high frequency only within Chalkidiki trees. No statistical significant differences were found between the allele frequencies of plus and control trees which implies that there is no relation between the 13 gene loci assayed and oleoresin yield. Conclusively, it could be said that the results are quite encouraging for the “rebirth” of oleoresin tapping in Greece. Clonal tests should follow in order to specify which of the selected phenotypes are indeed the best genotypes. Moreover, progenies of the selected trees are expected to have higher oleoresin yield. Finally, selection of high yielding oleoresin trees from other Greek territories should follow in the future.

Η ρητίνη αποτελεί ένα δασικό προϊόν με ιδιαίτερη οικονομική αξία. Τα επιμέρους συστατικά της χρησιμοποιούνται σε πολλούς τομείς της βιοτεχνίας και βιομηχανίας. Η παραγωγή της προέρχεται από διάφορα κωνοφόρα δέντρα ανά την υφήλιο, ενώ στην Ελλάδα τα είδη της χαλεπίου, τραχείας και μαύρης πεύκης είναι αυτά που έχουν ρητινευτεί κατά περιόδους, με κύριο ρητινοπαραγωγό είδος τη χαλέπιο πεύκη. Η παραγωγή ρητίνης στη χαλέπιο πεύκη (Pinus halepensis) παρουσιάζει μεγάλη διακύμανση καθώς ενώ η μέση ετήσια παραγωγή στον Ελληνικό χώρο ανέρχεται στα 2,7kg κατ’ άτομο, έχουν εντοπιστεί και περιπτώσεις όπου η ετήσια παραγωγή ξεπερνά τα 12kg. Πρωταρχικός σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν ο εντοπισμός ρητινευόμενων δέντρων που είναι υψηλοαποδοτικά σε ρητίνη στις περιοχές της Κασσάνδρας Χαλκιδικής και Κιρύνθου Ευβοίας. Ύστερα από υπόδειξη ντόπιων ρητινοσυλλεκτών, εντοπίστηκαν στην περιοχή της Χαλκιδικής 22 παραγωγικά άτομα με μέση ετήσια παραγωγή περίπου 18kg, ενώ στην περιοχή της Εύβοιας εντοπίστηκαν 11 άτομα με μέση ετήσια παραγωγή 24kg. Επιπλέον, στην κάθε περιοχή εντοπίστηκαν άτομα χαλεπίου πεύκης με μέση ετήσια παραγωγή μικρότερη των 2kg (στείρα). Από τα επιλεγμένα άτομα έγινε συλλογή δειγμάτων ρητίνης και κώνων με σκοπό την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση της ρητίνης και την ταυτοποίηση με ισοενζυμικούς δείκτες των επιλεγμένων ατόμων. Η ανάλυση της ρητίνης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Αέριου Χρωματογράφου – Φασματογράφου Μάζας (GC-MS) και από την οποία προέκυψε η ποιοτική και ποσοτική σύσταση της ρητίνης κάθε ατόμου. Συνολικά εντοπίστηκαν 40 συστατικά εκ των οποίων τα 11 μονοτερπένια (35,12%), τα 12 σεσκιτερπένια (1,40%) και τα υπόλοιπα 17 διτερπένια (63,50%). Τα κυριότερα συστατικά είναι τα διτερπένια μεθυλική αβιετάτη & αβιετικό οξύ (39,06%), παλουστρικό οξύ (9,47%), ισοπιμαρικό οξύ (5,64%), νεοαβιετικό οξύ (5,14%) και το μονοτερπένιο α-πινένιο (32,93%). Η ανάλυση των ποσοτικών δεδομένων με βάση το μέσο όρο του κάθε συστατικού με τη χρήση του μη-παραμετρικού Mann-Whitney test, κατέδειξε πως 10 συστατικά διαφοροποιούν τα παραγωγικά από τα στείρα άτομα, ενώ 14 συστατικά διαφοροποιούν τα άτομα της Χαλκιδικής από τα άτομα της Εύβοιας. Στα ίδια δεδομένα εφαρμόστηκε η κλιμακωτή #ιαχωριστική Ανάλυση η οποία κατέληξε σε 3 συστατικά (κυκλοεξανοκαρβοξυλικό οξύ, αφυδροαβιετικό οξύ και γ-τερπινένιο) ικανά να κατατάξουν τα δέντρα στην ομάδα από την οποία προέρχονται. Το συνολικό ποσοστό σωστής ταξινόμησης των δέντρων στην ομάδα που ανήκουν ανέρχεται στο 72,5% περιπτώσεων. Επιπλέον, 47 σημαντικές συσχετίσεις (r>0,80) βρέθηκαν μεταξύ 21 συστατικών. Οι περισσότερες εξ αυτών βρέθηκαν μεταξύ των 12 σεσκιτερπενίων. Η ισοενζυμική ανάλυση των ενδοσπερμίων πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αμύλου. Από τα 13 ενζυμικά συστήματα που δοκιμάστηκαν, ευκρινή και σταθερά αποτελέσματα δώσανε τα 11 με 17 γονιδιακές θέσεις, εκ των οποίων οι 13 ήταν πολυμορφικές (P=73,53%). Ο συνολικός αριθμός των αλληλομόρφων που εντοπίστηκαν ήταν 33, ο μέσος αριθμός αλληλομόρφων ανά γονιδιακή θέση ήταν A= 1,853 ενώ, ο μέσος δραστικός αριθμός αλληλομόρφων ήταν #e= 1,395. Με την ανάλυση των γενετικών παραμέτρων υπολογίστηκε η μέση παρατηρούμενη ετεροζυγωτία H o=0,255, η μέση αναμενόμενη ετεροζυγωτία H e= 0,244, η γενετική ποικιλότητα μεταξύ των δύο πληθυσμών DST=0,012 και ο συντελεστής γενετικής ποικιλότητας GST=0,041. Η ταυτοποίηση των επιλεγμένων ατόμων με τη χρήση των ισοενζύμων ήταν δυνατή καθώς, από συνολικά 49 άτομα προέκυψαν 49 διαφορετικοί γενότυποι με τη βοήθεια των 13 πολυμορφικών γονιδιακών θέσεων. Οι δύο πληθυσμοί, Χαλκιδικής και Εύβοιας, βρέθηκε ότι διαφέρουν στατιστικά σημαντικά στις συχνότητες τεσσάρων γονιδιακών θέσεων (IDH-B, LAP, β-EST και ACP-B) και επιπλέον, το αλληλόμορφο β- EST-1 εντοπίστηκε σε πολύ μεγάλη συχνότητα μόνο μεταξύ των ατόμων της Χαλκιδικής. Από τη σύγκριση των συχνοτήτων των αλληλομόρφων των παραγωγικών και των στείρων ατόμων δεν προέκυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι δε συνδέονται με κάποιο τρόπο οι συγκεκριμένες γονιδιακές θέσεις με την παραγωγή ρητίνης. Συμπερασματικά, θα μπορούσαμε να πούμε ότι πρέπει να συνεχιστεί η προσπάθεια αναγέννησης της ρητινοσυλλογής στη χώρα μας. Θα πρέπει να ακολουθήσουν πειράματα κοινού περιβάλλοντος ώστε να εξακριβωθεί ποιοι από τους επιλεγμένους φαινοτύπους είναι όντως και οι καλύτεροι γενότυποι. Επίσης, οι διασταυρώσεις μεταξύ των επιλεγμένων ατόμων αναμένεται να δημιουργήσουν άτομα με ακόμη μεγαλύτερη παραγωγή ρητίνης. Τέλος, ο εντοπισμός και άλλων παραγωγικών ατόμων από τις υπόλοιπες ρητινοπαραγωγές περιοχές της χώρας μας, θα καλύψει όλο το εύρος των διαφορετικών περιβαλλόντων για την πετυχημένη εγκατάσταση φυτειών με σκοπό την παραγωγή ρητίνης.