Ανάπτυξη μεθόδων μεταφοράς βιομορίων με τη χρήση νανοσωματιδίων

Abstract

Several problems associated with free drugs and vaccines such as lowsolubility, poor stability and unwanted side effects, had led to developingnovel drug delivery systems. Although various innovative delivery systemshave been introduced, there still remains need for further improvement of theissues. In the past few decades particle-based delivery systems have beenenormously investigated to resolve these problems.In particular, the use of biodegradable polymeric nanoparticles withentrapped drugs or antigens represents an exciting approach for controllingthe release of drugs and vaccines. Among polymeric particles, poly (D, Llactide-co-glycolide) (PLGA)–based nanoparticles (NPs) are one of the mostfrequently studied delivery carriers for drugs, peptides, proteins, vaccines andnucleotides. PLGA is a copolymer composed of lactic acid and glycolic acidand is one of a few polymers approved for medical purposes due to itsbiodegradability and nontoxicity.The aim of the present thesis was the production of biodegradablePLGA NPs for efficient protein and DNA delivery to cells and tissues.Nanoparticles were produced by the double emulsion and solvent evaporationtechnique, after the determination of several process parameters affectingtheir physicochemical properties. The produced nanoparticles were fullycharacterized with respect to size, surface charge and morphology. Therelease profile of the encapsulated DNA, as well as the integrity of DNAextracted from nanoparticles, were also examined.The evaluation of potential NP toxicity showed that cell viability isreduced only at nanoparticles concentrations greater than 1 mg/ml. Uptakestudies revealed that nanoparticles were internalized as early as within 30minutes after incubation and that they were distributed around the cytoplasmand the peri-nuclear space. Moreover, the in vitro uptake studiesdemonstrated that cellular uptake of nanoparticles is a concentration-, timeandtemperature- dependent process and that the uptake was inhibitedsignificantly by lowering the incubation temperature at 4ºC, and by thepresence of inhibitors like sodium azide and cytochalasin D. The aboveresults suggest that uptake is an active process and that endocytosis is themain internalization mechanism of nanoparticles in vitro. After first-line in vitro assays, characterization of cellular effects by thedorsal air pouch model was straightforward. It was clearly established thatPLGA NPs possess in vivo immunomodulatory activity since they attractpolymorphonuclear cells (PMNs). Furthermore, intramuscular injection ofpMAX-GFP NPs resulted in enhanced GFP expression in quadriceps musclein Balb/c mice. Finally, it was demonstrated that after oral administration ofFITC loaded PLGA NPs in Balb/c mice nanoparticles can be detected in theintestine within 30 minutes after feeding. Significant levels of gene expressionit was also detected when mice were fed with PLGA NPs containing pMAXGFPplasmid, 12 days after the first immunization.Consequently, the results of the present doctoral thesis underline thepotential of PLGA NPs, produced by double emulsion, as carriers for proteinand DNA delivery. Plasmid-loaded NPs can provide localized and sustainedrelease into the target tissue, and thus have the potential to enhance theefficiency of naked DNA at promoting gene expression. The understanding ofnanoparticles properties may facilitate their application to fields such as DNA vaccination, by various routes of administration.

Πολυάριθμα προβλήματα που σχετίζονται με τα ελεύθερα φάρμακα και τα εμβόλια, όπως η μικρή διαλυτότητα, η φτωχή σταθερότητα και οι ανεπιθύμητες παρενέργειες, έχουν οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων. Μολονότι έχουν παρουσιαστεί αρκετά καινοτόμα συστήματα μεταφοράς εξακολουθεί να υπάρχει ανάγκη βελτίωσης των θεμάτων αυτών. Τις τελευταίες δεκαετίες, τα συστήματα μεταφοράς που βασίζονται σε σωματίδια έχουν διερευνηθεί εκτεταμένα για την επίλυση των προβλημάτων. Συγκεκριμένα, η χρησιμοποίηση βιοαποικοδομήσιμων πολυμερικών νανοσωματιδίων με ενσωματωμένα φάρμακα ή εμβόλια αντιπροσωπεύουν μία συναρπαστική προσέγγιση όσον αφορά τον έλεγχο της αποδέσμευσης των ουσιών. Μεταξύ των πολυμερικών σωματιδίων, τα νανοσωματίδια που στηρίζονται στο πολυ(γαλακτικό-γλυκολικό)οξύ (PLGA) αποτελούν έναν από τους πιο συχνά μελετημένους φορείς μεταφοράς φαρμάκων, πεπτιδίων, πρωτεϊνών, εμβολίων και νουκλεοτιδίων. Το PLGA είναι ένα συμπολυμερές αποτελούμενο από γαλακτικό οξύ και γλυκολικό οξύ και είναι ένα από τα λίγα πολυμερή που έχει εγκριθεί για φαρμακευτικούς σκοπούς χάρη στη βιοαποικοδομησιμότητα και την έλλειψη τοξικότητας. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων PLGA NPs για αποτελεσματική μεταφορά πρωτεϊνών και DNA, σε κύτταρα και ιστούς. Τα νανοσωματίδια παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο του διπλού γαλακτώματος και εξάτμισης του διαλύτη, αφού προηγήθηκε ο προσδιορισμός της επίδρασης ποικίλλων παραγόντων στις φυσικοχημικές ιδιότητες των παραγόμενων νανοσωματιδίων. Τα νανοσωματίδια που προέκυψαν χαρακτηρίστηκαν πλήρως ως προς το μέγεθος, το επιφανειακό τους φορτίο και τη μορφολογία τους ενώ ακολούθησε μελέτη της δομικής και λειτουργικής ακεραιότητας του ενσωματωμένου DNA και της αποδέσμευσης του από τα νανοσωματίδια. Αξιολόγηση της πιθανής τοξικότητας των νανοσωματιδίων in vitro έδειξε ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώνεται μόνο σε συγκεντρώσεις νανοσωματιδίων ανώτερες των 1 mg/ml. Διερεύνηση της πρόσληψης αποκάλυψε ότι τα νανοσωματίδια εισέρχονται στο εσωτερικό των κυττάρων από τα πρώτα 30 λεπτά της επώασης και διανέμονται ομοιόμορφα στο κυτταρόπλασμα και τον περι-πυρηνικό χώρο. Επιπρόσθετα, διερεύνηση των παραγόντων που επηρεάζουν την in vitro πρόσληψη των νανοσωματιδίων αποκάλυψε ότι πρόκειται για μία διεργασία που παρουσιάζει δοσο- και χρονο- εξαρτώμενο χαρακτήρα και ότι αναστέλλεται σε σημαντικό βαθμό μειώνοντας τη θερμοκρασία επώασης στους 4οC και από την παρουσία αναστολέων όπως το NaN3 και η κυτοχαλαζίνη D. Τα παραπάνω αποτελέσματα συνηγορούν ότι η πρόσληψη είναι μία ενεργητική διαδικασία και ότι είναι πιθανό να στηρίζεται σε κάποιο μηχανισμό ενδοκύττωσης. Μετά από τις δοκιμές πρώτης γραμμής in vitro, ακολούθησε ο χαρακτηρισμός των κυτταρικών επιδράσεων με το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα. Με το μοντέλο αυτό έγινε δυνατός ο αξιόπιστος και ταχύς χαρακτηρισμός της ανοσοτροποποιητικής δράσης των νανοσωματιδίων που προκαλούν ενεργοποίηση των μηχανισμών της έμφυτης ανοσίας στον αεροθύλακα. Ιδιαιτέρως ικανοποιητικά ήταν τα αποτελέσματα της in vivo πρόσληψης των νανοσωματιδίων και αποτελεσματικής μεταφοράς του φορτίου τους, μέσω δύο διαφορετικών οδών χορήγησης. Ενδομυϊκή χορήγηση pMAX-GFP NPs είχε ως αποτέλεσμα την έκφραση της πρωτεΐνης GFP στους τετρακέφαλους μύες των ποντικών. Από την άλλη, 30 μόλις λεπτά μετά τη στοματική χορήγηση νανοσωματιδίων φορτωμένων με FITC σε ποντίκια της φυλής Balb/c, τα νανοσωματίδια εντοπίστηκαν στο έντερο. Ανιχνεύτηκαν επίσης σημαντικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης όταν τα ποντίκια ταΐστηκαν με PLGA NPs που περιείχαν το πλασμίδιο pMAX-GFP, 12 ημέρες μετά την πρώτη ανοσοποίηση, τη στιγμή που κάτι τέτοιο κατέστη αδύνατο με γυμνό πλασμιδιακό DNA.Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής θέσης υπογραμμίζουν τη δυνατότητα χρησιμοποίησης των PLGA NPs που παρασκευάστηκαν ως φορέων πρωτεϊνών και DNA. Τα νανοσωματίδια που είναι φορτωμένα με πλασμίδιο μπορούν να παρέχουν τοπική και συνεχή απελευθέρωση στον ιστό στόχο, και συνεπώς παρουσιάζουν τη δυνατότητα ενίσχυσης της δραστικότητας του γυμνού DNA προς έκφραση. Η κατανόηση των ιδιοτήτων των νανοσωματιδίων θα μπορούσε να διευκολύνει την εφαρμογή τους σε πεδία όπως ο DNA εμβολιασμός, μέσω ποικίλλων οδών χορήγησης.