Ανάλυση περιοχών με διαφορική μεθυλίωση σε ανευπλοειδίες

Abstract

Epigenetic DNA modifications are widely investigated in respect of their mechanisms, role and potential applications for the prediction, diagnosis and monitoring of abnormalities. The most studied epigenetic modification is DNA methylation which is used as a marker in cancer genetics and fetal medicine.The investigation of the fetal genetic constitution is one of the most important concerns in prenatal diagnosis. Fetal aneuploidy, with trisomy 21 (Down syndrome) being the most frequent, is detected by fetal karyotype and molecular cytogenetics techniques subsequent to invasive procedures. Such procedures are chorionic villus sampling (CVS) and amniocentesis, while fetal blood sampling is rare. These procedures implicate a relative risk for pregnancy loss and other complications. In order to avoid this risk, maternal serum biochemical screening and ultrasonography is conducted; nevertheless their detection rate is unsatisfactory.The discovery that fetal cells and cell free fetal DNA (cffDNA) circulates in maternal peripheral blood has given a new perspective to the non-invasive prenatal detection of fetal aneuploidy. The past few years, research has focused on the study of cffDNA by Next Generation Sequencing (NGS) based technologies as well as fetal-maternal methylation differences. NGS-based technologies are proven to be of great potential and are currently used for clinical applications. However, they present certain limitations, some of which could be overcome by epigenetic-based methodologies.One of the epigenetic approaches is based on fetal-maternal differentially methylated regions (DMRs) which are used for the enrichment of the fetal cell free DNA fraction in maternal plasma by Methylation Dependent Immuno Precipitation (MeDIP). MeDIP is combined with real time quantitative PCR (qPCR) so that fetal trisomy 21 could be detected. This method is proven to be of high sensitivity and specificity; however there is a great deal of improvement that could be done.In this study, some of the method’s key points were modified and changes were evaluated in order to adapt them in an improved version. Moreover, due to the importance of sampling, storing and shipping procedures, the efficiency of blood sampling in STRECK tubes was tested instead of sampling in standard K+/EDTA tubes. It was shown that maternal blood samples in STRECK tubes do not require immediate processing and the given time frame and shipping conditions do not affect cffDNA in a way that might interfere with producing reliable results.The MeDIP step is very important since it is relatively complicated; it requires precise and accurate handling and is a stage where bias could be introduced. The one-step vs two-step incubation (Ab-DNA and Ab-DNA-magnetic bead) comparison shows that the one step protocol is as efficient, thus reducing time, complexity, labor and bias. Reducing the MeDIP reaction volume generated comparable results, allowing testing with less starting cffDNA quantity, which is already limited. The reduction of the amount of antibody and magnetic beads used per MeDIP reaction produced good results making the new version more cost effective.Following the adoption of the improved modifications there was an efficiency test for the method’s new version. It is shown that the modified protocol can efficiently detect and quantify DMRs for the non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21.This study demonstrated the successful improvement of the previously developed MeDIP-qPCR methodology for non-invasive prenatal diagnosis (NIPD) of Down syndrome. This method is promising, with great potential for expanding towards more aneuploidy or even other chromosomal abnormalities detection. The continuous improvement is important in order to investigate the fetal genetic constitution exploiting epigenetic procedures.

Οι επιγενετικές τροποποιήσεις του DNA αποτελούν ευρύ αντικείμενο μελέτης σε ότι αφορά τους μηχανισμούς, το ρόλο τους και τις δυνητικές εφαρμογές τους στην πρόβλεψη, διάγνωση και παρακολούθηση παθολογικών καταστάσεων. Η καλύτερα μελετημένη επιγενετική τροποποίηση είναι η μεθυλίωση του DNA.Η διερεύνηση της γενετικής σύστασης του εμβρύου αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα ζητήματα στην προγεννητική διάγνωση. Η διάγνωση ανευπλοειδιών του εμβρύου, με συχνότερη την τρισωμία 21 (σύνδρομο Down), πραγματοποιείται με τη διεξαγωγή του καρυοτύπου του εμβρύου και μεθοδολογίες της μοριακής κυτταρογενετικής μετά από επεμβατική λήψη ιστών του. Τέτοιες διαδικασίες είναι η λήψη χοριονικών λαχνών και η αμνιοπαρακέντηση, ενώ σπανιότερα γίνεται λήψη εμβρυϊκού αίματος. Οι μέθοδοι αυτές συνδέονται με κίνδυνο επιπλοκών στην κύηση και αποβολής του εμβρύου. Για την αποφυγή επιπλοκών, πραγματοποιούνται βιοχημικοί και υπερηχογραφικοί έλεγχοι οι οποίοι οδηγούν σε εκτίμηση του κινδύνου να πάσχει ένα έμβρυο, ωστόσο, η ανιχνευσιμότητά τους δεν είναι αρκετά ικανοποιητική.Η ανακάλυψη της κυκλοφορίας εμβρυϊκών κυττάρων και ελεύθερου εμβρυϊκού DNA (cffDNA, cell free fetal DNA) στο περιφερικό αίμα της εγκύου άνοιξε νέους ορίζοντες για την μη επεμβατική ανίχνευση ανευπλοειδιών. Τα τελευταία χρόνια, οι περισσότερες έρευνες εστιάζουν στη μελέτη του cffDNA μέσω τεχνολογιών αλληλούχησης του DNA (NGS, Next Generation Sequencing) και μελέτης της διαφορικής μεθυλίωσης του DNA μητέρας και εμβρύου. Οι τεχνολογίες οι οποίες βασίζονται σε NGS είναι δυναμικές και έχουν σήμερα κλινική εφαρμογή. Παρουσιάζουν, παρ’ όλα αυτά, σημαντικούς περιορισμούς ορισμένους από τους οποίους θα μπορούσαν οι «επιγενετικές» προσεγγίσεις να υπερκεράσουν.Μια από τις επιγενετικές προσεγγίσεις βασίζεται στις διαφορές μεθυλίωσης μητρικού και εμβρυϊκού DNA (DMRs, Differentially Methylated Regions) στο περιφερικό αίμα της εγκύου και τον εμπλουτισμό του cffDNA με την ανοσοκατακρήμνιση μεθυλιωμένου DNA (MeDIP, Methylation Dependent Immuno Precipitation). Μετά τον εμπλουτισμό του cffDNA με MeDIP ακολουθεί ποσοτική ανίχνευση των περιοχών DMRs με τελικό αποτέλεσμα την ανίχνευση ή όχι τρισωμίας 21 στο έμβρυο. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε αποδείχθηκε ότι έχει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα ωστόσο, επιδέχεται βελτιώσεων.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τροποποιήσεις σε ορισμένα κομβικά σημεία της μεθοδολογίας, οι οποίες αξιολογήθηκαν για την επίδραση τους στην απόδοση των σταδίων αυτών προκειμένου να ενσωματωθούν σε αυτήν. Επιπλέον, λόγω της κρισιμότητας της διαδικασίας της συλλογής, διατήρησης και μεταφοράς των δειγμάτων μέχρι την ανάλυση, εξετάστηκε η καταλληλότητα της συλλογής δειγμάτων περιφερικού αίματος της εγκύου σε ειδικά σωληνάρια STRECK αντί των συνηθέστερα χρησιμοποιούμενων, τα οποία περιέχουν αντιπηκτικό Κ+/EDTA.Η μελέτη έδειξε ότι η επεξεργασία των δειγμάτων περιφερικού αίματος δεν είναι απαραίτητο να γίνει άμεσα και ότι είναι δυνατή η μεταφορά τους χωρίς ο χρόνος που μεσολαβεί και οι δεδομένες συνθήκες μεταφοράς να είναι καθοριστικές παράμετροι για την καταλληλότητα των δειγμάτων και τη διεξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Το στάδιο της ανοσοκατακρήμνισης μεθυλιωμένου DNA είναι ίσως το κρισιμότερο στάδιο της μεθοδολογίας, καθώς είναι σχετικά πολύπλοκο, απαιτεί ακριβείς και λεπτούς χειρισμούς και κατά το οποίο είναι δυνατή η εισαγωγή σφαλμάτων. Η σύμπτυξη των δυο σταδίων επώασης (αντίσωμα-DNA και συμπλόκου Ab-DNA-μαγνητικών σφαιριδίων) ήταν επιτυχής μειώνοντας το χρόνο από 4 σε 3 ώρες, την πολυπλοκότητα και τον κόπο για τους χειρισμούς καθώς και την συνακόλουθη εισαγωγή σφαλμάτων. Η μείωση του όγκου της αντίδρασης ανοσοκατακρήμνισης του μεθυλιωμένου DNA οδήγησε σε αποτελέσματα τα οποία είναι το ίδιο καλά σε σχέση με το αρχικό πρωτόκολλο, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο την οικονομικότερη διαχείριση της ήδη περιορισμένης ποσότητας του cffDNA, εξασφαλίζοντας τη μεγαλύτερη διαθεσιμότητά του για περεταίρω διερευνήσεις. Η μείωση της ποσότητας του αντισώματος και των μαγνητικών σφαιριδίων ανά αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης οδήγησε και αυτή σε αποτελέσματα συγκρίσιμα με αυτά της αρχικής μεθοδολογίας μειώνοντας το κόστος της. Στη συνέχεια διεξήχθη μελέτη της αποτελεσματικότητας και της ευαισθησίας της ανίχνευσης DMRs. Δείχθηκε ότι η τροποποιημένη μεθοδολογία επιτρέπει την αποτελεσματική ανίχνευση των DMRs.Η παρούσα μελέτη έδειξε την επιτυχή βελτιστοποίηση της υπάρχουσας προσέγγισης (MeDIP-qPCR) για την μη επεμβατική ανίχνευση της τρισωμίας 21 από το περιφερικό αίμα της εγκύου. Η μέθοδος είναι υποσχόμενη, με δυνατότητα επέκτασης σε περισσότερες ανευπλοειδίες ή και άλλες χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Είναι σημαντική η διερεύνηση παραμέτρων για την περαιτέρω βελτιστοποίηση της προκειμένου να είναι εφικτή η μελέτη της γενετικής σύστασης του εμβρύου με επιγενετικές προσεγγίσεις.