Μελέτη χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε χρόνιες λεμφουπερπλαστικές παθήσεις με την τεχνική του φθορίζοντος in situ υβριδισμού (FISH)

Abstract

Fluοrescent in situ hybridization (FISH) is superior to conventional cytogenetics for the detection of chromosomal changes in B- chronic lymhoproliferative disorders (B-CLD). Ιt has been used extensively in B-Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) and in smaller series of patients with other B-CLDs. The purpose of this study was to detect chromosomal changes in patients with B-CLDs and correlate FISH findings with clinical data, identify potential differences between disease subtypes and investigate FISH contribution to differential diagnosis. Τhe patient population consisted of 42 patients with B-CLL, 18 with Small Lymphocytic Lymphoma (SLL), 13 with Lymphoplasmacytic Lymphoma/ Waldenstrom macroglobulinemia (LPL/MW) and 15 with Splenic Marginal Zone Lymphoma (SMZL). Chromosomal aberrations studied were 13q deletion and trisomy 12 for all patients, 6q21 deletion for LPL/MW and trisomy 3 for SMZL. FISH analysis was based on standard protocols which include mononuclear cell separation and fixation, slide preparation and pretreatment, hybridization with specific probes, post hybridization washes and finally scoring slides under fluorescence microscope. The incidence of del13q was 55% in B-CLL patients, 10% in previously untreated SLL patients, 16.7% in all SLL patients, 7.7% in LPL and 6.6% in SMZL. Trisomy 12 was observed in 25% of B-CLL patients, 60% of previously untreated SLL patients, 56% of all SLL patients, 8.3% of LPL/MW and 0% of SMZL. Del6q was not detected in any of the LPL/MW patients tested. The incidence of trisomy 3 in SMZL was 21% and the presence of this alteration seems to facilitate differential diagnosis and final classification of ambiguous cases.Τhe incidence of all the chromosomal changes studied was in accordance with published data with the exception of del6q in LPL/MW. The difference between the incidence of 13q deletion in B-CLL and SLL was statistically significant (p=0.028), whereas for the incidence of trisomy 12 there was a trend that did not reach statistical siugnificance. Median treatment free interval (TFI) was 41.8 months for B-CLL versus 2.5 months for SLL (p=0.0001). 7-year overall survival (OS) was 67% for B-CLL patients and 58% for SLL. In univariate analysis of B-CLL patients male gender, LDH, β2-microglobulin and lymphocyte doubling time ( LDT) < 6 months were adverse prognostic factors for TFI and male gender, clinical stage, CD38 expression, LDT and β2-microglobulin for OS. In multivariate analysis LDH (p=0.013), LDT (p=0.003) and clinical stage B or C versus A (p=0.03) were independent prognostic factors for TFI and LDT (p<0.001), clinical stage B or C versus A (p=0.012) for OS with a borderline significance of CD38 expression(p= 0.06). When a univariate analysis was performed including all B-CLL and SLL patients SLL diagnosis (p=0.0001), LDH (p=0.034), CD38 (p=0.025), β2-microglobulin (p=0.004), trisomy 12 (p=0.04) and male gender (p=0.06) had prognostic signioficance for TFI. Male gender (p=0.03), CD38 (p=0.0015) and β2-microglobulin were adverse prognostic factors for OS. In the present study, a detailed comparison between B-CLL and SLL was performed in view of clinical and laboratory features. These two entities represent the leukemic and non-leukemic counterpart of the same disease. FISH analysis revealed cytogenetic differences that have not been previously reported. The most frequent chromosomal aberration of B-CLL, del13q, is rare in SLL, whereas trisomy 12 is very frequent in the absence of leukemic picture. The biologic significance of these differences is not known and requires further investigation. Finally, another important contribution of the FISH technique is that it facilitates the differential diagnosis and final classification of B-CLDs, especially for subtypes without pathognomonic specific findings and for ambiguous cases.

Η τεχνική του φθορίζοντος in situ υβριδισμού (FISH) υπερέχει σαφώς του κλασσικού καρυοτύπου για την ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε Β- ΧΛΥΠ. Έχει χρησιμοποιηθεί εκτενέστατα στη Β-ΧΛΛ και σε μικρότερες σειρές ασθενών στις υπόλοιπες κατηγορίες Β-ΧΛΥΠ. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η αναζήτηση χρωμοσωμικών βλαβών με την τεχνική FISH σε ασθενείς με Β-ΧΛΥΠ, και ο συσχετισμός των ευρημάτων με κλινικά δεδομένα, η συγκριση των ευρημάτων στις διαφορετικές υποκατηγορίες και η διερεύνηση της πιθανής συμβολής στη διαφορική διάγνωση. Στη μελέτη μας συμπεριλήφθηκαν 42 ασθενείς με Β-ΧΛΛ στη διάγνωση, 18 ασθενείς με ΛμΛ κλινικού σταδίου Ann Arbor ΙV, 13 με ΛΠΛ/ΜW και 15 ασθενείς με ΣΛΟΖ. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες που μελετήθηκαν ήταν η έλλειψη 13q14 και η τρισωμία 12 σε όλους τους ασθενείς, η τρισωμία 3 στους ασθενείς με ΣΛΟΖ και η έλλειψη 6q21 στους ασθενείς με ΛΠΛ/ΜW. Η τεχνική FISH εφαρμόστηκε με βάση καθιερωμένα πρωτόκολλα που περιλαμβάνουν τα στάδια του διαχωρισμού και της μονιμοποίησης κυττάρων, την προεργασία, τον υβριδισμό με κατάλληλους ανιχνευτές, εκπλύσεις μετά τον υβριδισμό και τελικά την παρατήρηση των κυττάρων με καταμέτρηση φθοριζόντων σημάτων στο μικροσκόπιο φθορισμού. Η συχνότητα της έλλειψης 13q14 ήταν 55% στους ασθενείς με Β-ΧΛΛ, 10% στους ασθενείς με ΛμΛ χωρίς προηγούμενη θεραπεια και 16.7% στο σύνολο των ασθενών με ΛμΛ, 7.7% στους ασθενείς με ΛΠΛ και 6.6% στους ασθενείς με ΣΛΟΖ. H συχνότητα της τρισωμίας 12 ήταν 25% στους ασθενείς με Β-ΧΛΛ, 60% στους ασθενείς με ΛμΛ χωρίς προηγούμενη θεραπεία και 56% στο σύνολο των ασθενών με ΛμΛ, 8.3% στους ασθενείς με ΛΠΛ/ΜW και 0% στους ασθενείς με ΣΛΟΖ. Η έλλειψη 6q21 δεν ανευρέθη σε κανέναν ασθενή με ΛΠΛ. Η συχνότητα της τρισωμίας 3 ήταν 21% στους ασθενείς με ΣΛΟΖ και η παρουσία της βλάβης αυτής φαίνεται να συμβάλλει στην τελική ταξινόμηση αμφιλεγόμενων περιπτώσεων. Οι συχνότητες που παρατηρήθηκαν είναι σύμφωνες με αυτές που έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία με εξαίρεση την έλλειψη 6q21 στο ΛΠΛ/MW. Η διαφορά της συχνότητας της έλλειψης 13q14 μεταξύ Β-ΧΛΛ και ΛμΛ ήταν στατιστικώς σημαντική (p=0.028) ενώ η διαφορά στην τρισωμία 12 ήταν οριακή (p=0.08). Το διάμεσο διάστημα έως την έναρξη θεραπείας (ΔΕΘ) ήταν 41.8 μήνες για τους ασθενείς με Β-ΧΛΛ και 2.5 μήνες για τους ασθενείς με ΛμΛ (p=0.0001). Η επταετής συνολική επιβίωσή (ΣΕ) ήταν 67% για τους ασθενείς Β-ΧΛΛ και 58% για τους ασθενείς με ΛμΛ. Στην μονοπαραγοντική ανάλυση που έγινε στους ασθενείς με Β-ΧΛΛ προγνωστική σημασία για το ΔΕΘ είχαν το άρρεν φύλο, η LDH, η β2-μικροσφαιρίνη και ο χρόνος διπλασιασμού των λεμφοκυττάρων (ΧΔΛ) και για τη ΣΕ το άρρεν φύλο, το κλινικό στάδιο, το CD38, o ΧΔΛ και η β2-μικροσφαιρίνη. Απο την πολυπαραγοντική ανάλυση προκύπτει ότι ανεξάρτητη προγνωστική σημασία για το ΔΕΘ είχε η LDH (p=0.013), o ΧΛΔ (p=0.003) και το κλινικό στάδιο Β ή C έναντι του σταδίου Α (p=0.03) και για τη ΣΕ ο ΧΛΔ (p<0.001) το κλινικό στάδιο B ή C (p=0.012) και οριακά η έκφραση του CD38 (p=0.06). Οταν συμπεριλήφθηκαν όλοι οι ασθενείς με Β-ΧΛΛ και ΛμΛ σε μονοπαραγοντική ανάλυση προγνωστική σημασία για το ΔΕΘ είχε η διάγνωση ΛμΛ (p=0.0001), η LDH (p=0.034), το CD38 (p=0.025), η β2-μικροσφαιρίνη (p=0.004), η τρισωμία 12 (0.04) και οριακά το άρρεν φύλο (p=0.06). και για τη ΣΕ το άρρεν φύλο( p=0.03), το CD38 (p=0.0015) και η β2-μικροσφαιρίνη (p=0.02). Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας έγινε λεπτομερής σύγκριση των κλινικοεργαστηριακών χαρακτηριστικών της Β-ΧΛΛ και του ΛμΛ, δύο κλινικών οντοτήτων που αποτελούν τη λευχαιμική και την ιστική μορφή της ίδιας πάθησης. Με την τεχνική FISH διαπιστώθηκε ότι η συχνότερη χρωμοσωμική ανωμαλία της Β-ΧΛΛ, η έλλειψη 13q είναι σπανιότατη στο ΛμΛ, ενώ η τρισωμία 12 είναι πολύ συχνή όταν δεν υπάρχει λευχαιμική εικόνα. Οι διαφορές αυτές δεν έχουν περιγραφεί έως τώρα, η βιολογική τους σημασία δεν είναι γνωστή και χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Η τεχνική FISH, συνολικά συνεισφέρει στη διαφορική διάγνωση και ταξινόμηση των Β-ΧΛΥΠ, ιδιαίτερα για τις παθήσεις χωρίς παθογνωμονικούς δείκτες και για τις αμφιλεγόμενες περιπτώσεις.