Ανάλυση γενετικού υπόβαθρου σε ασθενείς με οικογενή υπερχοληστερολαιμία. Συσχέτιση γονότυπου-φαινότυπου

Abstract

Familial hypercholesterolemia is an autosomal dominant disease with a prevalence of 1:500. The disease is mainly caused by mutations in the low density lipoprotein receptor gene (LDLR). It is characterised mainly by high serum total cholesterol levels and LDL-C above 200mg/dL. The great variability in lipid levels and the prevalence of coronary artery disease may not be solely explained by the type of LDLR mutation. Other factors such as the environment and modifying genes have been found to affect the phenotype of the disease. The aims of the study were (a) to identify mutations in LDLR gene (number, type, frequency) in familial hypercholesterolemia patients, (b) to find out their distribution in Greece, (c) to correlate the mutations with the phenotype and (d) to analyse genes involved in the development of coronary artery disease and lipid metabolism for common polymorphisms and correlate them with the phenotype. Using DGGE and DNA sequencing analysis, we found 17 mutations were found on the LDLR gene in 67 probands and 11 relatives. Mutations were located in the promoter and 8 different exons (2, 5, 6, 8, 9, 11, 12 and 14) of the LDLR. Among them 11 were missense mutations, two were nonsense mutations, 3 were splice defects (2140+5G>A and 2140+9C>T, 1706-10 G>A) and 1 one was a nucleotide substitution (-45delT) on the promoter. The mutations V408M, G528D, C6W and S265R, account for 73% of heterozygous familial hypercholesterolemia probands. V408M mutation is more common in Central West, while C6W is more common in Central East. From the above mutations A410T, A519T, and the splice site defects 2140+9 C>T are detected for the first time in the Greek population and -45delT is mentioned for the first time worldwide. Expression studies for the newly reported -45delT mutation revealed that the patient bearing the mutated allele had reduced expression to 5% of normal which resulted in reduction of LDL-R binding properties by 76%. Dividing the patients into two groups, receptor defective and receptor negative carriers it was shown that receptor negative carriers have higher total and LDL cholesterol levels, and 6-fold higher incidence of xanthomas. Apart from the genetic analysis performed in LDLR and ApoB genes, analysis in genes known to be involved in biochemical pathways implicated in the progression and the development of cardiovascular disease. The presence of the E4 allele for the ApoE genotype is not associated with lipid levels or the incidence of coronary disease in familial hypercholesterolemia. Other polymorphisms investigated are PON 2 Ser311Cys, LPL Asn291Ser, PAI-1 T11053G, FGB G-455A, NOS A-922G and ANP T2238C and G644A. The PON2 Cys311 allele was correlated with high total and LDL cholesterol and apolipoprotein B levels, while LPL Asn291, PAI-1 T11053, FGΒ G-455 and NOS A-922 allele were correlated with high apolipoprotein B levels. Only the A allele of the ANP G644A was associated with lower levels of Apo-A and HDL-C. These results suggest the Greek population is very homogenous regarding the LDLR mutations compared to others. The type of LDLR mutation affects the clinical phenotype of familial hypercholesterolemia and other genes seem to be involved in the determination of the lipid profile of patients.

Η οικογενής υπερχοληστερολαιμία είναι αυτοσωμική επικρατής νόσος που προσβάλει 1 στα 500 άτομα. Η ασθένεια αυτή οφείλεται κυρίως σε μεταλλάξεις στο γονίδιο του υποδοχέα της λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας (Low Density Lipoprotein Receptor-LDLR). Χαρακτηρίζεται κυρίως από υψηλά επίπεδα ολικής χοληστερόλης ορού και LDL χοληστερόλη μεγαλύτερη από 200mg/dL. Η μεγάλη διακύμανση στα επίπεδα λιπιδίων και στην συχνότητα εμφάνισης στεφανιαίας νόσου αποδίδεται όχι μόνο στον τύπο της μετάλλαξης στον LDLR, αλλά και στην έκφραση άλλων ρυθμιστικών γονιδίων καθώς επίσης και σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η διατροφή και η φυσική δραστηριότητα. Στόχοι της διατριβής ήταν (α) η ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο του LDLR (αριθμός, είδος, συχνότητα) σε ασθενείς με οικογενή υπερχοληστερολαιμία, (β) η κατανομή των μεταλλάξεων στην Ελλάδα, (γ) η συσχέτισή τους με την κλινική εικόνα της νόσου (δ) η ανάλυση γνωστών πολυμορφισμών σε άλλα γονίδια που εμπλέκονται στην εξέλιξη της στεφανιαίας νόσου και στο μεταβολισμό των λιπιδίων και η συσχέτισή τους με τον φαινότυπο. Για την ανάλυση των μεταλλάξεων εφαρμόστηκε η μέθοδος ηλεκτροφόρησης σε κλίση αποδιατακτικών παραγόντων (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis-DGGE) ανάγνωση της πρωτοδιάταξης του DNA. Ταυτοποιήσαμε 17 μεταλλάξεις στο γονίδιο του LDLR σε 67 ασθενείς και 11 συγγενείς του. Οι μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στον υποκινητή και σε οκτώ εξόνια (2, 5, 6, 8, 9, 11, 12, και 14) του LDLR. Έντεκα από τις μεταλλάξεις είναι παρερμηνεύσιμες, δύο είναι ανερμηνεύσιμες, τρεις βρίσκονται στα όρια μεταξύ εσονίου και εξονίου (splice site) και μία οφείλεται σε έλλειψη ενός νουκλεοτιδίου στον υποκινητή του LDLR (-45delT). Μεταξύ αυτών οι V408M, G528D, C6W και S265R, βρέθηκαν σε ποσοστό 73% στους ασθενείς που ήταν φορείς μεταλλάξεων. Η μετάλλαξη V408M παρατηρήθηκε με μεγάλη συχνότητα στην κεντρική Δυτική Ελλάδα ενώ η C6W είναι πιο συχνή στην κεντρική Ανατολική Ελλάδα. Οι μεταλλάξεις Α410Τ, Α519Τ, 1706-10 G>A και 2140+9 C>T, βρέθηκαν για πρώτη φορά στην Ελλάδα και η -45delT αναφέρθηκε για πρώτη φορά στον κόσμο. Πειράματα έκφρασης για τη μελέτη της πρωτοαναφερόμενης μετάλλαξης -del45T έδειξαν μείωση της έκφρασης του μεταλλαγμένου αλληλομόρφου στο 5% με αποτέλεσμα τη μείωση της ικανότητας πρόσδεσης του LDL-R στην LDL κατά 76%. Χωρίζοντας τους ασθενείς σε φορείς μετάλλαξης ελαττωματικού υποδοχέα και φορείς μετάλλαξης αρνητικού υποδοχέα, παρατηρήθηκε ότι οι φορείς μετάλλαξης αρνητικού υποδοχέα παρουσιάζουν υψηλότερα επίπεδα ολικής και LDL χοληστερόλης, και έξι φορές μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης ξανθωμάτων. Η ύπαρξη του αλληλομόρφου Ε4 για τον γονότυπο της ΑpoE δεν συνδέεται με τα επίπεδα λιπιδίων αλλά ούτε και με τη συχνότητα εμφάνισης στεφανιαίας νόσου. Άλλοι πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν είναι οι PON 2 Ser311Cys, LPL Asn291Ser, PAI-1 T11053G, FGB G-455A, NOS A-922G και ANP T2238C και G644A. Για τον πολυμορφισμό PON 2 Ser311Cys, οι φορείς του αλληλομόρφου Cys παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα ολικής και LDL χοληστερόλης και Apo-B. Υψηλότερα επίπεδα Apo-B παρουσίασαν επίσης οι ομοζυγώτες για το αλληλόμορφο Asn στη θέση 291 της LPL, οι φορείς του αλληλομόρφου T στη θέση 11053 του γονιδίου PAI, οι φορείς του G αλληλομόρφου στη θέση -455 του γονιδίου FGB και οι φορείς του αλληλομόρφου A για τον πολυμορφισμό NOS A-922G. Από τους πολυμορφισμούς G644A και C2238T στο γονίδιο ANP το αλληλόμορφο Α στη θέση 644 συνδέεται με χαμηλότερα επίπεδα Apo-A και HDL-C. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο Ελληνικός πληθυσμός είναι αρκετά ομοιογενής σε σύγκριση με άλλους, ως προς τις μεταλλάξεις στον LDLR. Ο τύπος της μετάλλαξης του LDLR επηρεάζει τον φαινότυπο της οικογενούς υπερχοληστερολαιμίας ενώ στην διαμόρφωση λιπιδαιμικού προφίλ των ασθενών φαίνεται να εμπλέκονται και άλλα γονίδια.