Συσχέτιση HLA - DQ πολυμορφισμού με γενετική προδιάθεση για σακχαρώδη διαβήτη τύπου Ι

Abstract

Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a multifactorial autoimmune disease, which is characterized by T cell mediated selective destruction of the insulin secreting pancreatic ß-cells of the islets of Langerhans and subsequent irreversible insulin defficiency. Susceptibility to the disease is influenced by both genetic and environmental factors. The genome screens confirmed that the HLA gene region (IDDM1 locus) is the major genetic determinant of disease risk, accounting for 42% of the familial inheritance of T1DM, while the insulin gene region (IDDM2 locus) contributes a further 10% of genetic susceptibility.The well recognized associations between HLA loci and T1DM have proven exceedingly difficult to dissect, due to the strong linkage disequilibrium that exists between the HLA genes, which makes it difficult to study their individual roles. In recent years it became evident that haplotypes / phenotypes rather than single locus products might define IDDM predisposition/protection. Furthermore, comparing results from different populations help in understanding the biology of IDDM. The aim of this study was to investigate the contribution of the various HLA Class II alleles, haplotypes and phenotypes and their interaction in the protection against or susceptibility to development of T1DM in Greek T1DM patients. For this purpose extensive DNA typing (PCR- SSOP) of HLA-DRB1,-DQA1, DQB1 alleles was performed in 80 unrelated Greek diabetic patients (fulfilling the diagnostic criteria for T1DM) and 246 unrelated, healthy Greek caucasoid individuals. The results revealed, also in Greek diabetic patients the classical T1DM susceptibility haplotypes: DRB1 *0405,DQA1 *0301 ,DQB 1 *0302 (DR4/DQ8) (RR=6.49), DRB1 *0401 ,DQA1 *0301 ,DQB 1*0302 (DR4/DQ8) (RR=5.98), DRB1 *0301,DQA1 *0501,DQB 1*0201 (DR3/DQ2) (RR=6.53). Furthermore, an additional combinatiom DRB 1*0405, DQA1*0301,DQB 1*0201 (DR4/DQ2) (RR=4.13), which is normally rare in other European populations, was found to be significantly increased in Greek T1DM patients. Besides the classical protective haplotypes DRB 1 * 15,DQA1 *0102,DQB 1 *0602 (DR15/DQ6) (RR=0.06), DRB1*13,DQA1*0103,DQB1*0603 (DR13/DQ6) (RR=0.06) the DRB1*1101,DQA1*0501,DQB1*0301(RR=0.2), DRB1*1104,DQA1*0501,DQB1*0301 (DR11/DQ7) (RR=0.13) haplotype frequencies were also significantly decreased in Greek diabetic patients. Our data in Greek population, together with recent data from other populations, clearly demonstrates an hierarchy of T1DM associations among the many different DR4 alleles and haplotypes. In particular, in DR4/DQ8 (DRB1*04/DQB1*0302) haplotypes. DRB 1*0405 confers a higher risk than DRB 1*0401,while DRB 1*0403 is protective. As DRB1*0403/DQB 1*0302 is the most common DRB1*04 haplotype in greek healthy population,our study confirms to some extent the hypothesis of a genetic basis for the low incidence of T1DMM in Greece..This hypothesis also correlates with the high frequency of the protective DQB1 *0301 ( DQ7) in the normal population. The genetic data indicates that HLA class II molecules play a critical role in determining susceptibility and resistance to T1DM. Understanding these HLA molecules at the biochemical and structural level is therefore critical for defining their role in the disease process. By comparing the published protein structures of HLA-DR,-DQ molecules, we discovered that there were conserved similarities between the T1D predisposing HLA molecules that contrasted with the shared patterns observed between the HLA protective molecules. The data provides evidence for a joint action of the HLA class II peptide binding pockets PI, P4 and P9 in disease susceptibility and resistance, with a main role for P9 in DQ (which is shaped by the critical β57 residue - both DQ8 and DQ2 carry an alanine in β57 residue, while DQ6 and DQ7 encode an aspartic acid) and for P1,P4 in HLA-DR. The observed distribution of HLA class II alleles among Greek patients and controls strongly supports the notion that specific combinations of susceptible and protective alleles of HLADRB1,- DQB1,-DQA1 loci are critical in determiining the risk of T1DM The finding that particular HLA- DR,-DQ mplecules confer susceptibility may lead to new methods of preventing development of T1DM in susceptible individuals.

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 1 (ΣΔΤ-1, ινσουλινοεξαρτώμενος σακχαρώδης διαβήτης) θεωρείται σήμερα ένα ετερογενές, πολυπαραγοντικό, πολυγονιδιακό, αυτοανόσου αιτιολογίας νόσημα, στο οποίο η αυτοάνοση διεργασία στρέφεται επιλεκτικά κατά των β-κυττάρων των παγκρεατικών νησιδίων , που παράγουν ινσουλίνη. Για την ανάπτυξη του ανοσολογικού μηχανισμού που καταστρέφει τα β-κύτταρα, απαραίτητη είναι η επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων σε γενετικά προδιατεθειμένα άτομα. Από τους γενετικούς παράγοντες ιδιαίτερα έχουν συσχετιστεί τα γονίδια του MHC στο χρωμόσωμα 6 (42%) με κύρια, αλλά όχι μοναδική, συμμετοχή των HLA-DQB1,-DRB1 γονιδιακών θέσεων,καθώς και η περιοχή της ρυθμιστικής αλληλουχίας επαναλήψεων στο 5’ άκρο του γονιδίου της ινσουλίνης στο χρωμόσωμα 11 (10% ). Η επίδραση των HLA-DR και HLA-DQ μορίων στον κίνδυνο εμφάνισης ΣΔΤ-1 πιθανά σχετίζεται με τον κεντρικό ρόλο των μορίων αυτών στην αντιγονοπαρουσίαση και στην Τ κυτταρομεσολαβούμενη ανοσιακή απάντηση.Οι HLA- συσχετίσεις με ΣΔΤ-1 εμφανίζουν μεγάλη ανομοιογένεια μεταξύ των διαφόρων πληθυσμιακών ομάδων, που οφείλεται τόσο στην διαφορετική κατανομή των HLA αλληλομόρφων στο γενικό πληθυσμό, όσο και στη διαφορετική ανισορροπία σύνδεσης μεταξύ τους. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν μοριακές τεχνικές υψηλής διακριτικής ανάλυσης, για τη μελέτη του πολυμορφισμού των HLA-τάξης II DRB1/ DQB1/ DQA1 αλληλομόρφων σε 80 παιδιά Ελληνικής καταγωγής που έπασχαν από ΣΔΤ-1 και 246 φυσιολογικούς υγιείς μάρτυρες. Σκοπός ήταν ο προσδιορισμός και η ιεράρχηση των HLA-DRB1,-DQA1,-DQB1 απλοτύπων και γονοτύπων που συσχετίζονται με επιδεκτικότητα ή προστασία για την εμφάνιση ΣΔΤ-1 στον Ελληνικό πληθυσμό, η μελέτη της αλληλεπίδρασης των HLA γονιδίων και του κινδύνου εμφάνισης της νόσου, καθώς και η σύγκριση των προδιαθεσικών και προστατευτικών για την ανάπτυξη ΣΔΤ-1 HLA- DR,- DQ μορίων σε επίπεδο μοριακής δομής, για τον καθορισμό των στερεοχημικών αλλαγών που ευθύνονται για τη διαφοροποίηση της αλληλεπίδρασης με πιθανά διαβητογόνα πεπτίδια. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν και στον Ελληνικό πληθυσμό τη κλασσική θετική συσχέτιση των HLA-DRB 1*0301 /DQA 1*0501 /DQB1 *0201 (OR=6.53), HLADRB1 *0405/DQAl *0301 /DQB 1*0302 (OR=6.49), HLA-DRB1*0401/DQA1*0301/DQB1*0302 (OR=5.98), απλοτύπων ( που κωδικοποιούν τη σύνθεση των HLA-DR3/DQ2 και DR4/DQ8 μορίων αντίστοιχα) με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης ΣΔΤ-1.0 σχετικός κίνδυνος μάλιστα για ανάπτυξη ΣΔΤ-1 είναι πολύ αυξημένος στα ετερόζυγα άτομα στα οποία συνεκφράζονται οι δύο παραπάνω απλοτύποι (OR=19.87). Ομως, στατιστικά σημαντικός για επιδεκτικότητα στους Ελληνες, βρέθηκε και ο απλότυπος HLA-DRB1*0405/DQA1*0301/DQB1*0201 (HLA-DR4/DQ2) (ρ=0.005, OR=4.13), σπάνιος σε άλλους Ευρωπαϊκούς Καυκάσιους πληθυσμούς. Αντίθετα ισχυρά119προστατευτικός διεπιστώθη ο HLA-DRB1 * 1101/04//DQA1 *0501 //DQB 1*0301 απλότυπος (OR=0.13-0.23), καθώς και οι γνωστοί «προστατευτικοί» HLA DRB1*15/DQA1*0103/DQB1*0602 (DR15/DQ6) και HLA DRB1*13/ DQA1*0103/ DQB1*0603 (DR13/DQ6) απλότυποι, που απούσιαζαν τελείως από την ομάδα των ασθενών.. Το γεγονός ότι και στους δύο DRB1*04 απλοτύπους (HLA-DR4/DQ8, HLA-DR4/DQ2) στην ομάδα των ασθενών, επικρατούσε το DRB1*0405 αλληλόμορφο, υποδεικνύει άμεση εμπλοκή του DRB1*0405 αλληλομόρφου στην γενετική προδιάθεση για ΣΔΤ-1 στους Ελληνες. Η ισχύς επιδεκτικότητας που προσδίδεται από το DQB1*0302 αλληλόμορφο στους HLA-DR4/DQ8 (ORBI*04/DQBl*0302) απλοτύπους φαίνεται ότι τροποποιείται ανάλογα με το DRB1 αλληλόμορφο με το οποίο συνδυάζεται: το DRB 1*0405 προσδίδει τον υψηλότερο κίνδυνο για ανάπτυξη ΣΔΤ-1 , ακολουθεί το DRB*0401, ενώ αντίθετα το DRB 1*0403 θεωρείται προστατευτικό. Επομένως η στατιστικά σημαντική μείωση της συχνότητας του DRB1*0403/ DQB1*0302 απλοτύπου στους διαβητικούς ασθενείς που μελετήθηκαν (ενώ είναι ο συχνότερος στη ομάδα των φυσιολογικών μαρτύρων ) ενισχύει την άποψη ότι οι διάφοροι DRB1*04 υπότυποι, έχουν ρυθμιστικό ρόλο και προσδίδουν διαφορετικού βαθμού προστασία στους εμπλεκόμενους HLA-DQB απλοτύπους. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης επιτρέπουν την υπόθεση ότι ο χαμηλός επιπολασμός του ΣΔΤ-1 που παρατηρείται στον Ελληνικό πληθυσμό, σε σχέση με άλλους Ευρωπαϊκούς πληθυσμούς, έχει γενετική βάση και οφείλεται στη χαμηλή συχνότητα του «προδιαθεσικού» DQB 1*0302 (HLA-DQ8) σε συνδυασμό με την υψηλή συχνότητα των «προστατευτικών» DQB 1*0301 (HLA-DQ7) και HLA-DRB 1*0403 στον φυσιολογικό πληθυσμό.Επιπλέον, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι λόγω της αλληλεπίδρασης των HLA γονιδίων, δημιουγείται μια ιεράρχηση των επιδεκτικών/προστατευτικών απλοτύπων, που ξεκινά από τον πολύ υψηλού κινδύνου γονότυπο που φέρει 6 διαβητογόνα αλληλόμορφα ( HLA-DRB1*0301- DQA1*0501-DQB1*0201/DRB1*0405-DQA1*0301-DQB1*302 ετερόζυγος συνδυασμός ) και καταλήγει στον πλέον προστατευτικό γονότυπο που φέρει τα ισχυρά προστατευτικά αλληλόμορφα μόνα τους (HLA-DRB1*1104-DQA1*0501-DQB1*0301/DRB1*1104-DQA1*0501-DQB1*301) ή σε συνδυασμό με ουδέτερα. Η ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας καθώς και η σύγκριση της μοριακής δομής των επιδεκτικών για ανάπτυξη ΣΔΤ-1 HLA-μορίων έδειξε ότι παρουσιάζουν κοινά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά στην αντιγονοπαρουσιαστική θήκη, συνεπώς και στην πεπτιδική εξιδίκευση. Δομικά διαφέρουν πολύ από τα προστατευτικά για τη νόσο HLA-μόρια τα οποία επίσης παρουσιάζουν μεγάλες ομοιότητες μεταξύ τους. Ειδικώτερα η επιδεκτικότητα ή η προστασία εξαρτάται από την συνδυασμένη δράση των κυρίων εσοχών πρόσδεσης του αντιγονικού πεπτιδίου στη σχισμοειδή θήκη του μορίου (Ρ1, Ρ4, Ρ9), όπου κύριο ρόλο έχουν η Ρ9 για τα HLA-DQ μόρια (το αμινοξικό περιεχομένο της θέσης DQß 57 παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση αυτής) και οι P1, Ρ4 για τα HLA-DR. Οι δομικές διαφορές που παρατηρούνται στα HLA μόρια έχουν σαν120αποτέλεσμα διαφοροποίηση στη δυνατότητά τους να δεσμεύουν τα «διαβητογόνα» πεπτίδια, γεγονός που καθορίζει την εμφάνιση ή όχι του νοσήματος, αν και ο επιλεκτικός μηχανισμός δεν είναι γνωστός. Η παρούσα μελέτη, με τη μοριακή ανάλυση των HLA γονιδίων επιβεβαιώνει ότι τα HLA-DR.-DQ μόρια είναι κύριοι καθοριστές της γενετικής προδιάθεσης για ανάπτυξη ΣΔΤ-1 και στον Ελληνικό πληθυσμό.Η συσχέτιση αυτή όμως, είναι προφανώς αποτέλεσμα συνδυασμού της δράσης των HLA- DRB,-DQA,-DQB γενετικών τόπων που δρούν σαν σύμπλεγμα. Η μοριακή δομή συγκεκριμένων HLA μορίων, οδηγεί πιθανώς στην επιλογή ενός αυτοδραστικού Τ ρεπερτορίου. Η αποσαφήνηση του μοριακού μηχανισμού με τον οποίο ένα HLA μόριο προσδίδει επιδεκτικότητα για ανάπτυξη ΣΔΤ-1 'θα θα επιφέρει την ανάπτυξη νέων ανοσοθεραπευτικών σχημάτων που θα προλαμβάνουν τόσο την έναρξη όσο και την προοδευτική εγκατάσταση της αυτοανόσου διεργασίας