Κλινική αξιολόγηση της έκφρασης του γονιδίου PRMT-1 (protein arginine methyltransferase-1) στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Abstract

Cancer consists a major Public Health issue worldwide as it is recognized as the second most common cause of death, behind cardiovascular diseases. In particular, colorectal cancer has been associated with the western life-style and dietary habits. The fact that more than one million cases of colorectal cancer are diagnosed worldwide each year, make the discovery of new biological markers more imperative and necessary, not only for diagnostic and prognostic purposes, but also for the development and introduction of new therapeutic approaches. This has been the main motive for the designing and working out of the present thesis. The biological background of colon cancer disease has already been studied extensively and is under continuous consideration. Nevertheless, there are many genes, that although they are not directly connected to colon cancer, they could offer a great deal of information on the disease progression. Protein Arginine Methyltransferase 1 gene (PRMT1) was thought to be one of them. This gene encodes an enzyme implicating in many important aspects of cell metabolism via arginine methylation of certain protein molecules. PRMT1’s participation in metabolism made us consider studying this molecule and correlating its expression to colon cancer. In the present study, the expression levels of PRMT1 splice variants were analyzed in a variety of colon tissues (normal, cancerous, adenomas, inflammatory disease tissue).In the course of our study, we were also able to correlate the expression levels of PRMT1 with clinical and pathological parameters and we found that PRMT1-v2 was the only PRMT1 variant associated in a statistically significant manner with all clinicopathological parameters examined. More specifically, PRMT1-v2 expression seemed to increase during the progression process from normal tissue to adenoma and finally carcinoma, whereas it was definitely increased colon cancer tissues versus normal tissues. On the contrary, in inflammatory (IBD) colon tissues, PRMT1-v2 expression was decreased versus normal tissues. These findings probably reveal that the positive expression of PRMT1-v2 is indicative of the progression and aggressiveness of the colon cancer disease. Advanced TNM stage (p=0.026), tumor grade (p=0.015)as well as positive nodal status (p=0.016) and patients’ age (p=0.004) were associated in a statistically significant manner with the positive expression of PRMT1-v2 (the percentage of patients expressing PRMT1 v2 was substantially higher in older patients compared to younger ones). Additionally, according to Cox univariate analysis, positive expression of PRMT1-v2 seemed to associate with a higher probability for patients’ relapse (p=0.01) or death (p=0.032) and correlate, also, with a statistically significant manner with OS ( p=0.039) and DFS ( p=0.01). As far as the other two isoforms (PRMT1-v1 and PRMT1-v3) are concerned, no statistically significant difference in expression analysis was recorded between normal and cancerous tissue. All three PRMT1 isoforms (v1, v2 and v3) did not differ concerning their expression, in a statistically significant manner, in adenomas in comparison with normal tissue whereas in IBDs, PRMT1-v2 showed lower expression in inflammatory versus normal tissue (p=0.021). On the other hand, multivariate analysis showed a statistically significant association between the positive expression of PRMT1-v2 and patients’ relapse (p=0.023). Moreover the experiments of immunohistochemical localization of the PRMT1 protein, using an in-house produced anti-PRMT1 antibody, indicated a mainly cytoplasmic presence. The results of this study converge to the characterization of the high expression of PRMT1-v2 as a marker of unfavorable prognosis for colon cancer patients.

Ο καρκίνος συνιστά ένα εξαιρετικά σημαντικό πρόβλημα για τη Δημόσια Υγεία σε παγκόσμιο επίπεδο αφού αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου μετά τα καρδιαγγειακά νοσήματα. Ειδικότερα, ο καρκίνος του παχέος εντέρου (ΚΠΕ) έχει συσχετισθεί με το δυτικό τρόπο ζωής και διατροφής. Το γεγονός ότι περισσότερο από ένα εκατομμύριο νέα περιστατικά ΚΠΕ διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο καθιστά την ανάπτυξη βιολογικών δεικτών ιδιαίτερα χρήσιμη τόσο για την έγκαιρη διάγνωση και πρόγνωση όσο και για την ανακάλυψη και εισαγωγή νέων θεραπευτικών επιλογών και προσεγγίσεων. Αυτό αποτέλεσε και το βασικό κίνητρο για την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Το βιολογικό υπόβαθρο της καρκινικής νόσου του παχέος εντέρου έχει μελετηθεί αρκετά και συνεχίζει να μελετάται. Υφίστανται, πάραυτα, γονίδια τα οποία παρότι φαινομενικά δεν συσχετίζονται με αυτό τον τύπο καρκίνου, μπορούν να προσφέρουν πληροφορίες σχετικά με την πρόοδο της νόσου. Ένα τέτοιο γονίδιο θεωρήθηκε ότι είναι κι αυτό της πρωτεϊνικής μεθυλοτρανσφεράσης αργινίνης 1 (PRMT1). Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται σε ποικίλα και σημαντικά σημεία του κυτταρικού μεταβολισμού, μέσω της μεθυλίωσης καταλοίπων αργινίνης συγκεκριμένων μορίων. Η συμμετοχή του πρωτεϊνικού προϊόντος του PRMT1 στον μεταβολισμό έδωσε την ώθηση στο να μελετηθεί και να συσχετιστεί με τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Η παρούσα μελέτη αφορά τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του PRMT1 σε ιστούς ασθενών που πάσχουν από καρκίνο του παχέος εντέρου, ιστούς προερχόμενους από αδενώματα και ιδιοπαθή φλεγμονώδη νοσήματα του παχέος εντέρου, καθώς και φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου. Κατά τη συσχέτιση της έκφρασης με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους προέκυψε στατιστικά σημαντική σχέση μεταξύ των παραμέτρων και της έκφρασης ενός εκ των τριών εναλλακτικών ισομορφών του PRMT1, του v2. Ειδικότερα, η έκφραση της ισομορφής v2 φάνηκε να αυξάνεται κατά την εξέλιξη από φυσιολογικό ιστό σε αδένωμα και καρκίνο. Παρατηρήθηκε να είναι αυξημένη σε ιστούς καρκίνου παχέος εντέρου σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς, ευρήματα που πιθανόν δείχνουν ότι η θετική έκφραση του PRMT1-v2 είναι ενδεικτική της εξέλιξης και της επιθετικότητας της νόσου. Αντίθετα, σε φλεγμονώδεις ιστούς με ΙΦΝΕ, η έκφραση του PRMT1-v2 ήταν μειωμένη συγκριτικά με τους φυσιολογικούς ιστούς. Το προχωρημένο ΤΝΜ στάδιο (p=0.026), ο βαθμός κακοήθειας του όγκου (p=0.015), η παρουσία θετικών λεμφαδένων (p=0.016) και η ηλικία των ασθενών (p=0.004) συνδέονταν με στατιστικά σημαντικό τρόπο με την θετική έκφραση της ισομορφής PRMT1-v2 ( οι ηλικιωμένοι ασθενείς εμφάνιζαν σε μεγαλύτερο βαθμό θετική έκφραση του γονιδίου). Επιπρόσθετα, η μονοπαραγοντική ανάλυση Cox έδειξε ότι οι ασθενείς που εκφράζουν θετικά την ισομορφή PRMT1-v2 παρουσιάζουν μεγαλύτερη πιθανότητα για υποτροπή (p=0.01) ή θάνατο (p=0.032) σε σύγκριση με τους ασθενείς που δεν εκφράζουν τη συγκεκριμένη ισομορφή ενώ η θετική έκφραση της ισομορφής PRMT1-v2 παρουσιάζει σημαντική συσχέτιση τόσο με την ελεύθερης νόσου επιβίωση ( p=0.01), όσο και με την ολική επιβίωση ( p=0.039) των ασθενών. Η πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox, συμπεριλαμβάνοντας σαν μεταβλητές την ηλικία των ασθενών και το μέγεθος του όγκου, έδειξε ότι η θετική έκφραση του PRMT1-v2 σχετίζεται στατιστικά σημαντικά με μεγαλύτερη πιθανότητα υποτροπής των ασθενών (p=0.023), αλλά όχι και με την ολική επιβίωση αυτών. Για τις ισομορφές PRMT1-v1 και ν3 δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά έκφρασης μεταξύ φυσιολογικού και καρκινικού ιστού.Όσον αφορά τα αδενώματα, και για τις 3 ισομορφές PRMT1, δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά έκφρασης σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό ενώ στα ΙΦΝΕ καταγράφηκε μειωμένη - με στατιστικά σημαντικό τρόπο - έκφραση του PRMT1-v2 στους φλεγμονώδεις σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς (p=0.021).Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοϊστοχημικού εντοπισμού της πρωτεΐνης, με αντίσωμα που φτιάχτηκε στο εργαστήριό μας, και υπέδειξαν την κατά κύριο λόγο κυτταροπλασματική παρουσία της πρωτεΐνης. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης συγκλίνουν προς τον χαρακτηρισμό της υψηλής έκφρασης της ισομορφής v2 του γονιδίου PRMT1 ως δείκτη κακής πρόγνωσης όσον αφορά τους ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.