Μελέτη των μεταβολών στην ομοιοστασία του πρωτεώματος κατά τη γήρανση: βιολογικός ρόλος των κύριων πρωτεολυτικών συστημάτων

Abstract

Organismal ageing is a multifactorial process modulated by the interplay between geneticand environmental factors, and it affects most, if not all, tissues and organs of the body. At thetissue level, ageing-related damage of biomolecules affects all types of cells and theextracellular matrix. The cleareance of proteome damage is achieved via the occurrence of acomplex and highly regulated network of effective surveillance, maintenance, and clearancesystems that ensure biomolecules’ functionality, thus preventing disruption of organismhomeostasis. Key players in preventing the breakdown of cellular proteostasis (homeostasisof the proteome) are the molecular chaperones, the oxidized protein repair enzymes MsrA andMsrB, the mitochondrial Lon protease, and the two main proteolytic systems (i.e., thelysosome and the proteasome), along with main antioxidant signaling pathway NFE2-relatedfactor 2 (Nrf2)/Keapl.Proteasome is central to proteostasis maintenance, as it degrades both normal anddamaged proteins. Herein, we undertook a detailed analysis of proteasome function andregulation in the in vivo setting of Drosophila melanogaster. We report that a major hallmarkof somatic tissues of ageing flies is the gradual accumulation of ubiquitinated andcarbonylated proteins; these effects correlated with a 50% reduction of proteasome expressionand catalytic activity. In contrast, gonads of ageing flies were relatively free of proteomeoxidative damage and maintained substantial proteasome expression levels and highly activeproteasomes. Moreover, gonads of young flies were found to possess more abundant andmore active proteasomes than somatic tissues. Exposure of flies to oxidants induced higher proteasome activities specifically in the gonads, which were, independently of age, moreresistant than soma to oxidative challenge and, as analyses in reporter transgenic flies showed,retained functional antioxidant responses. Finally, inducible Nrf2 activation in transgenic fliespromoted youthful proteasome expression levels in the aged soma, suggesting that agedependentNrf2 dysfunction is causative to decreasing somatic proteasome expression duringageing.As the impact of in vivo proteasome dysfunction on the proteostasis networks and ageingprocesses remain poorly understood, our study then was focused to this issue. We found thatRNAi-mediated knock down of 20S proteasome subunits in Drosophila melanogaster resultedin larval lethality. We therefore studied the molecular effects of proteasome dysfunction inadult flies by developing a model of dose-dependent pharmacological proteasome inhibition.Impaired proteasome function promoted several “old-age” phenotypes and markedly reducedflies’ lifespan. In young somatic tissues and in gonads of all ages, loss of proteasome activityinduced higher expression levels and assembly rates of proteasome subunits. Proteasomedysfunction was signaled to the proteostasis network by reactive oxygen species (ROS) that originated from malfunctioning mitochondria and triggered an Nrf2-dependent upregulationof the proteasome subunits. RNAi-mediated Nrf2 knock down reduced proteasome activities,flies resistance to stress, as well as longevity. Conversely, inducible activation of Nrf2 intransgenic flies, upregulated basal proteasome expression and activity independently of age,and conferred resistance to proteotoxic stress. Interestingly, prolonged Nrf2 over-expressionreduced longevity, indicating that excessive activation of the proteostasis pathways can bedetrimental.We then studied transgenic flies were the proteasomal subunits β1, β5, α4, α7, Rpn11,Rpn6, Rpn10 and Rpt6 expression was suppressed by RNAi. We found that reducedexpression of the β5, α7, Rpn11 and Rpn6 subunits caused larval lethality. Also, we noted theupregulation of proteasome subunits completely phenocopying thus the phenotypes observedwith PS-341. Interestingly, the finding that RNAi-mediated suppression of the subunits α4,β1, Rpn10 and Rpt6 allowed hatching of the adult fly indicates that some proteasome subunitscan be substituted allowing thus partial maintenance of proteasome function. In support, thefinding that suppression of α4 subunit expression does not cause significant increase inmortality is likely explained by a previous report showing that the α4 and α3 subunits exertsimilar functions. Nevertheless, the reduced longevity of these flies clearly indicates theabsence of fully functional proteasomes.Finally, considering that the advanced glycation end product (AGEs)-modified proteins (anon-enzymatic glycation of free amino groups of proteins) along with lipofuscin (a highlyoxidized aggregate of covalently cross-linked proteins, sugars and lipids) have been found to accumulate during ageing and in several age-related diseases, we studied the impact of oraladministration of glucose (Glc)-, fructose (Frc)-, or ribose (Rib)-modified albumin or ofartificial lipofuscin (LF) in our in vivo screening platform, namely Drosophila. We report thatcontinuous feeding of young Drosophila flies with culture medium enriched in AGEs or inlipofuscin resulted in reduced locomotor performance, in accelerated rates of AGEs-modifiedproteins and carbonylated proteins accumulation in the somatic tissues and the haemolymphof flies, as well as in a significant reduction of flies healthspan and lifespan. These phenotypiceffects were accompanied with reduced proteasome peptidase activities in both thehaemolymph and in somatic tissues of flies and higher levels of oxidative stress andproteasome expression levels; furthermore, oral administration of AGEs or lipofuscin in fliestriggered an upregulation of the lysosomal cathepsins B, L activities. Finally, RNAi-mediatedcathepsin D knockdown reduced flies longevity and significantly augmented the deleteriouseffects of AGEs and lipofuscin indicating that lysosomal cathepsins reduce the toxicity ofdiet-derived AGEs or lipofuscin.In conclusion, the present PhD Thesis provides novel evidence supporting differentialregulation of proteostasis maintenance and proteome clearance in the young organism, during ageing, or in response to oxidative challenge in the somatic tissues and the gonads ofDrosophila. Also, our findings support experimentally the trade-off theories of ageingevolution, where ageing is considered a consequence of increased energetic investment ingerm line (that preserves viability across generations) over soma (only needed to supportsurvival of a single generation) maintenance. Moreover, our in vivo studies add newknowledge on the proteotoxic stress-related regulation of the proteostasis networks in highermetazoans. Proteasome dysfunction triggers the activation of an Nrf2-dependent tissue- andage-specific regulatory circuit aiming to adjust the cellular proteasome activity according totemporal and/or spatial proteolytic demands. Prolonged deregulation of this proteostasiscircuit accelerates ageing. Finally, our in vivo studies demonstrate that chronic ingestion ofAGEs or lipofuscin disrupts proteostasis and accelerates the organismal functional declinethat occurs during normal ageing.

Η γήρανση είναι μία αναπόφευκτη διαδικασία σχεδόν για όλους τους οργανισμούς. Η εμφάνισή της σχετίζεται με τη σταδιακή συσσώρευση βλαβών κατά τη διάρκεια της ζωής,στις οποίες συμβάλλουν τόσο γενετικοί όσο και στοχαστικοί περιβαλλοντικοί παράγοντες. Αρκετά μονοπάτια έχουν εμπλακεί στην εξέλιξη της γήρανσης, κάποια από τα οποία είναι τα μεταβολικά μονοπάτια σηματοδότησης, το μονοπάτι των σιρτουϊνών (sirtuins), οι επιγενετικές τροποποιήσεις, η μείωση του μήκους των τελομερών, καθώς και τα μονοπάτια απόκρισης στο στρες. Επίσης, κατά τη γήρανση παρατηρείται αύξηση των μη ενζυματικών τροποποιήσεων των πρωτεϊνών, όπως για παράδειγμα οι οξειδωτικές τροποποιήσεις και οι τροποποιήσεις των πρωτεϊνών με σάκχαρα [τα λεγόμενα τελικά προϊόντα πρωτεϊνικής γλυκοζυλίωσης (Advanced Glycation End products)-AGEs]. Αυτές οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις οδηγούν στη δυσλειτουργία των πρωτεϊνών με αποτέλεσμα την αύξηση της πρωτεωμικής αστάθειας που μπορεί να οδηγήσει στην επιτάχυνση της γήρανσης, καθώς και στην εμφάνιση ασθενειών που σχετίζονται με το γήρας.Τα κυριότερα σηματοδοτικά μονοπάτια διατήρησης της πρωτεωμικής σταθερότητας είναι το μονοπάτι ουβικιτίνης-πρωτεασώματος, το μονοπάτι αυτοφαγίας-λυσοσώματος, καθώς και το κύριο σηματοδοτικό μονοπάτι αντι-οξειδωτικής απόκρισης Nrf2/Keap1. To σύστημα ουβικιτίνης-πρωτεάσωματος συμμετέχει στην αποικοδόμηση ουβικιτινιωμένων φυσιολογικών πρωτεϊνών με μικρό χρόνο ημιζωής, καθώς και μη λειτουργικών πρωτεϊνών τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτοσόλιο, καθώς επίσης και στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στο μιτοχόνδριο. Επίσης, φαίνεται πως το σύστημα ουβικιτίνης-πρωτεασώματος «συνομιλεί (αν και ο μοριακός μηχανισμός παραμένει άγνωστος) με το μονοπάτι της αυτοφαγίας, καθώς και με το σηματοδοτικό μονοπάτι αντιοξειδωτικής απόκρισης Nrf2/Keap1. Έχει παρατηρηθεί μείωση της ενεργότητας του πρωτεασώματος κατά την κυτταρική και την in vivo γήρανση. Επομένως, το πρωτεάσωμα συμβάλλει στη μοριακή διαδικασία της εμφάνισης και της εξέλιξης της γήρανσης, χωρίς επίσης, να είναι ξεκάθαρο πως ακριβώς συμβαίνει αυτό. Για το σκοπό αυτό είναι σημαντικό να μελετηθούν οι μεταβολές στην ομοιοστασία του πρωτεώματος, καθώς και να αναλυθεί ο βιολογικός ρόλος των κύριων πρωτεολυτικών συστημάτων κατά τη γήρανση. Επίσης, απαιτείται να πραγματοποιηθεί μια συστηματική ανάλυση των in vivo μοριακών μεταβολών μετά από γονιδιακή αποσιώπηση(RNAi) των διαφόρων πρωτεασωμικών υπομονάδων. Όπως ήδη αναφέρθηκε, τα AGΕs και οιοξειδωμένες πρωτεΐνες συσσωρεύονται κατά το γήρας και καθώς τα AGΕs βρίσκονται σε αρκετά τρόφιμα η μελέτη της in vivo επίδρασής τους στον οργανισμό παρουσιάζει επίσης ιδιαίτερο ενδιαφέρον.Σκοπός της παρούσας μελέτης υπήρξε η διερεύνηση όλων των παραπάνω ερωτημάτων invivo, στο πειραματικό μοντέλο Drosophila melanogaster. Η Drosophila είναι ιδανική για τέτοιου είδους μελέτες, καθώς το πρωτεάσωμα της είναι όμοιο με αυτό των θηλαστικών,συνδυάζει τόσο μετα-μιτωτικά όσο και μιτωτικά κύτταρα, ενώ μια σειρά από μεταβολικά μονοπάτια (συμπεριλαμβανομένου του μονοπατιού Nrf2/Keap1) είναι παρόμοια με αυτά των θηλαστικών. Τα ευρήματά μας έδειξαν τη δυσλειτουργία του πρωτεασώματος, τη συσσώρευση ουβικιτινιωμένων, οξειδωμένων πρωτεϊνών, καθώς και πρωτεϊνών που έχουν τροποποιηθεί με AGEs σε όλους τους σωματικούς ιστούς των εντόμων κατά την in vivo γήρανση. Επίσης,βρέθηκε ότι οι ωοθήκες και σπερματοθήκες των εντόμων είναι πιο ανθεκτικές σε σχέση με το σωματικό ιστό τόσο στις βλάβες που υπόκειται ο οργανισμός κατά την in vivo γήρανση όσο και στο εξωγενές οξειδωτικό στρες, αλλά και ενδεχομένως στη μερική αναστολή του πρωτεασώματος. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η καταστολή της έκφρασης βασικών πρωτεασωμικών υπομονάδων διαταράσσει την αυτοσυγκρότηση του πρωτεασώματος και δεδομένου ότι (όπως διαπιστώθηκε και στην παρούσα μελέτη) οδηγεί σε θνησιμότητα σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, αναπτύχθηκε ένα φαρμακολογικό μοντέλο όπου οι μοριακές αλλαγές λόγω υπο-λειτουργίας του πρωτεασώματος μελετήθηκαν μετά απόχορήγηση ειδικών πρωτεασωμικών αναστολέων. Παρατηρήθηκε ότι η μείωση της ενεργότητας του πρωτεασώματος στα νεαρά έντομα στα επίπεδα που παρατηρούνται σε γηρασμένα άτομα προκαλεί διαταραχή της πρωτεόστασης, μείωση της μυϊκής δύναμης των εντόμων και τελικά δοσο-εξαρτώμενη μείωση του προσδόκιμου ζωής. Επίσης, η υπολειτουργία της πρωτεασωμικής ενεργότητας σε νεαρά έντομα οδήγησε στη δοσοεξαρτώμενη επαγωγή της γονιδιακής και πρωτεϊνικής έκφρασης του πρωτεασώματος, καθώς και των αυτοσυγκροτημένων πρωτεασωμάτων. Η επαγωγή της έκφρασης του πρωτεασώματος στους σωματικούς ιστούς δεν παρατηρήθηκε, όταν γηρασμένα έντομα εκτέθηκαν στους πρωτεασωμικούς αναστολείς σε αντίθεση με τις ωοθήκες και σπερματοθήκες που διατήρησαν την ικανότητα επαγωγής της έκφρασης του πρωτεασώματος τόσο κατά τη γήρανση όσο και μετά από δυσλειτουργία του πρωτεασώματος. Ακόμα,βρέθηκε ότι η υπολειτουργία του πρωτεασώματος οδηγεί σε αύξηση των ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS) και του Η2Ο2 στους νεαρούς αλλά όχι γηρασμένους σωματικούς ιστούς,καθώς και ότι η παραγωγή ROS σηματοδοτεί την επαγωγή της έκφρασης του πρωτεασώματος. Στη συνέχεια, διαπιστώθηκε ότι η πρωτεασωμική δυσλειτουργία προκαλεί διαταραχή της ομοιοστασίας των μιτοχονδρίων, δυσλειτουργία της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης, καθώς και του μιτοχονδριακού συμπλέγματος ΙΙ/ΙΙΙ, γεγονός που συνάδει με την παρατηρούμενη αύξηση των ROS. Επίσης, με τη χρήση διαγονιδιακών εντόμων διαπιστώθηκε ότι η πρωτεασωμική δυσλειτουργία επάγει την αντιοξειδωτική άμυνα του κυττάρου στους σωματικούς ιστούς των νεαρών (αλλά όχι των γηρασμένων) εντόμων ενώ στις γονάδες παρατηρήθηκε επαγωγή των αντιοξειδωτικών μονοπατιών ανεξαρτήτως ηλικίας. Καθώς το κύριο μονοπάτι αντιοξειδωτικής απόκρισης είναι το μονοπάτι Nrf2/Keap1, ελέγξαμε αν σχετίζεται με την επαγωγή του πρωτεασώματος μετά από πρωτεασωμική δυσλειτουργία. Η μελέτη μας έδειξε ότι η επαγωγή του πρωτεασώματος μετά από πρωτεασωμική δυσλειτουργία σε νεαρά έντομα διαμεσολαβείται από τον μεταγραφικό παράγοντα Nrf2 στη Drosophila. Ακόμη, η παροδική υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Nrf2 σε νεαρά αλλά και σε γηρασμένα έντομα οδήγησε στην αύξηση της έκφρασης και ενεργότητας του πρωτεασώματος, καθώς και σε αυξημένη ανθεκτικότητα σε σύντομο πρωτεοτοξικό στρες. Βρέθηκε επίσης ότι η μακροχρόνια ενεργοποίηση του Nrf2 οδηγεί σε μείωση του προσδόκιμου ζωής. Η παρατήρηση αυτή δεικνύει ότι η παρατεταμένη ενεργοποίηση της αντιοξειδωτικής απόκρισης είναι επιβλαβής για τον οργανισμό. Επομένως,φαίνεται πως μόνο η ήπια παροδική ενεργοποίηση των συστημάτων διατήρησης της πρωτεόστασης είναι ωφέλιμη για τον οργανισμό. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν διαγονιδιακά έντομα που είχαν κατεσταλμένη την έκφραση των πρωτεασωμικών υπομονάδων β1, β5, α4, α7, Rpn11, Rpn6, Rpn10 και Rpt6. Το εύρημα ότι η μείωση της έκφρασης των υπομονάδων β5, α7, Rpn11 και Rpn6 προκαλεί θνησιμότητα στο στάδιο της λάρβας–προνύμφης, καθώς και επαγωγή της έκφρασης των υπόλοιπων πρωτεασωμικών υπομονάδων επιβεβαίωσε τις φαινοτυπικές μεταβολές που παρατηρήθηκαν μετά από επίδραση σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια με τον πρωτεασωμικό αναστολέα PS-341. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης το εύρημα ότι η καταστολή των υπομονάδων α4, β1, Rpn10 και Rpt6 επιτρέπει μεν τη εκκόλαψη του ενήλικου εντόμου, αλλά όταν τα ενήλικα έντομα μεταφέρθηκαν σε συνθήκες επαγωγής του διαγονιδίου εμφάνισαν μείωση του προσδόκιμου ζωής με εντονότερο φαινότυπο πρώιμης γήρανσης σε συνθήκες καταστολής της πρωτεασωμικής υπομονάδας Rpt6. Το αποτέλεσμα αυτό δεικνύει ότι η απουσία των υπομονάδων αυτών επιτρέπει τη συντήρηση της πρωτεασωμικής λειτουργίας ή ότι η μειωμένη τους έκφραση εξισορροπείται από άλλες υπομονάδες/πρωτεΐνες. Για παράδειγμα,το εύρημα ότι η καταστολή της α4 υπομονάδας δεν προκαλεί ραγδαία αύξηση της θνησιμότητας, πιθανώς να, εξηγείται από την παρατήρηση ότι η α4 και η α3 υπομονάδεςφαίνεται να έχουν παρόμοια λειτουργία. Όπως αναφέρθηκε, οι in vivo επιδράσεις των μη ενζυματικά τροποποιημένων πρωτεϊνώνAGEs ή της λιποφουσκίνης στη φυσιολογία του οργανισμού παρέμεναν άγνωστες. Η διατροφή στις δυτικές χώρες είναι αρκετά πλούσια σε AGEs, τα οποία σε μεγάλες συγκεντρώσεις συμβάλλουν στην αύξηση του οξειδωτικού στρες, καθώς και σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Παρομοίως, τόσο η in vivo όσο και η κυτταρική γήρανση συνοδεύονται από την ενδοκυτταρική συσσώρευση της λιποφουσκίνης στα λυσοσώματα. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, οι μελέτες μας έδειξαν ότι η κατανάλωση τροφής εμπλουτισμένης σε AGEs ή λιποφουσκίνη οδήγησε σε διαταραχή της πρωτεόστασης και σε δυσλειτουργία του πρωτεασώματος, καθώς και αύξηση του οξειδωτικού στρες. Επιπλέον,παρατηρήθηκε αύξηση της ενεργότητας των λυσοσωμικών καθεψινών, ενώ όταν εκτέθηκαν διαγονιδιακά έντομα που είχαν κατασταλμένη (μέσω RNAi) την ενεργότητα των καθεψινών σε τροφή εμπλουτισμένης σε AGEs ή λιποφουσκίνη εμφάνισαν πρώιμη γήρανση. Η παρατήρηση αυτή δεικνύει ότι οι λυσοσωμικές καθεψίνες έχουν κομβικό ρόλο στην αποικοδόμηση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων.Συνοπτικά, οι μελέτες της παρούσας ΔΔ υποστηρίζουν με πειραματικά ευρήματα την(εξελικτική) θεωρία του φθαρτού σώματος (Disposable soma theory), σύμφωνα με την οποία το σώμα είναι απαραίτητο μόνο για να διατηρεί ασφαλές το αναπαραγωγικό σύστημα, το οποίο γηράσκει με σχετικά αργούς ρυθμούς. Επίσης, για πρώτη φορά δείχθηκε σε in vivoσυνθήκες ότι τόσο η διαφορική ρύθμιση του πρωτεασώματος κατά τη γήρανση όσο και η ιστοειδική ρύθμιση του πρωτεασώματος υπό συνθήκες μειωμένης ενζυμικής ενεργότητας εξαρτώνται από το μονοπάτι σηματοδότησης Nrf2/Keap1. Επιπλέον, φαίνεται να υπάρχει διαφορική βαρύτητα των πρωτεασωμικών υπομονάδων όσον αφορά στην αυτοσυγκρότηση του πρωτεασώματος, την πρωτεασωμική λειτουργία και τελικά τη διατήρηση της ομοιοδυναμικής του κυττάρου. Τέλος, μια δίαιτα πλούσια σε AGEs ή λιποφουσκίνη επιταχύνει την εμφάνιση του γήρατος και, έτσι, πιθανολογούμε ότι η περιορισμένη κατανάλωση τροφών πλούσιων σε AGEs ή λιποφουσκίνη μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση του προσδόκιμου ζωής και/ή σε επιβράδυνση του ρυθμού των ασθενειών του γήρατος.