The role of inter-strain interactions on the growth, virulence and detection of Listeria monocytogenes

Abstract

The complexity of food ecosystems revolves around a set of intrinsic factors and a vast number of bacteria determined to live. The majority of the physicochemical processes that take place on foods and determine their quality and stability as final products, are linked to the “decisions” made by the residing food microorganisms. These decisions, regardless what their direction is, have social implications. Thus, whether food microorganisms are spoilage or pathogenic, their fate is dependent on their social interactions with their neighbours. Like with all food microorganisms, almost every basic aspect of L. monocytogenes life is governed by its interactions with bacteria living in close proximity. This bacterium is a major concern both for the food industry and health organizations since it is ubiquitous and able to withstand harsh environmental conditions. Due to the ubiquity of Listeria monocytogenes, various strains may contaminate foods in different stages of the supply chain potentially resulting in simultaneous exposure of consumers to multiple strains. Apparently if the presence of multiple L. monocytogenes strains on a single food or a food-associated surface affects the behaviour and characteristics of the strains (e.g., biochemical phenotypes) this gives rise to food safety issues. In this thesis we focused on the study of phenotypic responses of different L. monocytogenes strains in co-cultivation. The phenotypes under investigation were related to the growth potential, the in vitro virulence and the detectability after selective enrichment of the studied L. monocytogenes strains. Artificial antibiotic resistance to rifampicin or streptomycin was induced to the strains for selective enumeration purposes. In chapter 2 it was demonstrated that co-cultivation affects the fitness and in vitro virulence of L. monocytogenes strains in a strain-dependent manner. Strains with better fitness within a strain combination were found to be also highly invasive and were never outcompeted under competition situations. Cell-contact was shown to be involved both in growth and virulence competition between L. monocytogenes strains.In chapter 3 we used the ISO protocol for detection of L. monocytogenes in foods to co-enrich different combinations of L. monocytogenes strains. We found enrichment bias towards certain strains related to enrichment conditions and competition between L. monocytogenes strains. We also highlighted the importance of the growth substrate in interstrain interactions suggesting that certain types of foods due to their intrinsic properties may favor competition. The results of chapters 2 and 3 were used to build the hypothesis of chapter 4; in this chapter we investigated the effect of co-cultivation on the detection of L. monocytogenes strains in parallel to their ability to cope with gastric-acid stress and efficiently infect human intestinal epithelial cells. We demonstrated that strains which were well-suited to cope with barriers relevant to gastrointestinal tract were sometimes underrepresented during selective enrichment. We concluded that the difficulty to match foods (i.e., fsource) with the responsible L. monocytogenes strain (i.e. causative agent) during listeriosis outbreaks could be related to the occurrence of more than one strain in the same food and the different abilities of strains to cope and compete under different environments (i.e., enrichment conditions vs human gastrointestinal tract).

Η πολυπλοκότητα των οικοσυστημάτων των τροφίμων περιστρέφεται γύρω από ένα σετ ενδογενών παραγόντων και ένα πλήθος βακτηρίων αποφασισμένων να ζήσουν. Η πλειονότητα των φυσικοχημικών διεργασιών που λαμβάνουν χώρα στα τρόφιμα και καθορίζουν την ποιότητα και τη σταθερότητα τους ως τελικά προϊόντα συνδέονται με τις «αποφάσεις» των μικροοργανισμών που εδρεύουν σε αυτά. Αυτές οι αποφάσεις ανεξάρτητα από την κατεύθυνση τους έχουν κοινωνικές προεκτάσεις. Έτσι είτε οι μικροοργανισμοί των τροφίμων είναι αλλοιωγόνοι είτε παθογόνοι η μοίρα τους εξαρτάται από τις κοινωνικές τους αλληλεπιδράσεις με τους γείτονές τους. Όπως ισχύει για όλους τους μικροοργανισμούς τροφίμων έτσι και για το L. monocytogenes σχεδόν κάθε πτυχή της ζωής του κυβερνάται από τις αλληλεπιδράσεις του με βακτήρια που βρίσκονται σε εγγύτητα. Αυτό το βακτήριο αποτελεί κύρια ανησυχία της βιομηχανίας τροφίμων και των οργανισμών υγείας λόγω της ευρείας παρουσίας του αλλά και της ικανότητάς του να ανθίσταται σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες. Εξαιτίας της εκτενούς διάδοσής του L. monocytogenes, πολλαπλά στελέχη είναι δυνατό να επιμολύνουν τα τρόφιμα σε διάφορα στάδια της αλυσίδας εφοδιασμού τροφίμων καταλήγοντας πιθανόν σε ταυτόχρονη έκθεση των καταναλωτών σε παραπάνω του ενός στελέχη. Προφανώς αν η παρουσία πολλαπλών στελεχών σε ένα τρόφιμο η μια επιφάνεια σχετιζόμενη με τα τρόφιμα επηρεάζει τη συμπεριφορά και τα χαρακτηριστικά των στελεχών αυτών τότε εγείρονται θέματα ασφάλειας για τα τρόφιμα. Σε αυτήν τη διατριβή εστιάσαμε στη μελέτη ορισμένων φαινοτύπων διαφόρων στελεχών L. monocytogenes σε συγκαλλιέργεια. Οι υπό μελέτη φαινότυποι αφορούσαν το δυναμικό αύξησης, την in vitro παθογένεια και την ικανότητα ανίχνευσης μετά από επιλεκτικό εμπλουτισμό των μελετούμενων στελεχών. Στα στελέχη προκλήθηκε ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά ριφαμπικίνη και στρεπτομυκίνη ώστε να είναι δυνατή η διάκριση και επιλεκτική τους καταμέτρηση.Στο κεφάλαιο Ι δείξαμε ότι η ικανότητα ανάπτυξης και η in vitro παθογένεια των στελεχών του L. monocytogenes επηρεάζεται από τη συγκαλλιέργεια ανάλογα με τα στελέχη και τους συνδυασμούς των στελεχών που συγκαλλιεργούνται. Στελέχη με μεγαλύτερη ικανότητα να ανταγωνιστούν και να επικρατήσουν κατά την ανάπτυξη βρέθηκαν επίσης πιο ικανά και ανταγωνιστικά στο να διεισδύσουν στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα. Η κυτταρική επαφή μεταξύ των στελεχών φάνηκε να παίζει ρόλο στον μεταξύ τους ανταγωνισμό κατά την ανάπτυξη και την in vitro προσβολή των εντερικών κυττάρων. Στο κεφάλαιο ΙΙ χρησιμοποιήσαμε το πρωτόκολλο ISO για την ανίχνευση του L. monocytogenes στα τρόφιμα ώστε να εμπλουτίσουμε ταυτόχρονα σε συνδυασμούς διάφορα στελέχη L. monocytogenes. Παρατηρήσαμε πως οι συνθήκες εμπλουτισμού και ο ανταγωνισμός μεταξύ των στελεχών μπορεί να ευνοήσει την ανίχνευση συγκεκριμένων στελεχών ή να υποβαθμίσει την ανάκτηση κάποιων άλλων. Επίσης υπογραμμίσαμε την σημασία του υποστρώματος ανάπτυξης στις διαστελεχιακές αλληλεπιδράσεις σημειώνοντας πως συγκεκριμένα τρόφιμα λόγω των ενδογενών χαρακτηριστικών τους μπορεί να ευνοούν τον ανταγωνισμό μεταξύ των στελεχών. Τα αποτελέσματα των κεφαλαίων Ι και ΙΙ χρησιμοποιήθηκαν για να χτιστεί η υπόθεση του κεφαλαίου ΙΙΙ· σε αυτό το κεφάλαιο ερευνήσαμε την επίδραση της συγκαλλιέργειας στην ανίχνευση των στελεχών L. monocytogenes παράλληλα με την ικανότητα τους να ανταπεξέλθουν στο στρες προσομοιωμένου γαστρικού υγρού και να επιμολύνουν ανθρώπινα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα. Δείξαμε ότι κάποιες φορές στελέχη που μπορούσαν πολύ αποτελεσματικά να προσαρμοστούν σε συνθήκες σχετιζόμενες με την ανθρώπινη γαστρεντερική οδό (ΑΓΟ) ήταν δυνατόν να μην ανακτώνται μετά από επιλεκτικό εμπλουτισμό. Συμπερασματικά η δυσκολία να γίνει η σύνδεση του στελέχους L. monocytogenes που έχει προκαλέσει ασθένεια με το τρόφιμο από το οποίο προήλθε κατά τη διερεύνηση επιδημιών λιστερίωσης, θα μπορούσε να σχετίζεται με την ύπαρξη περισσότερων του ενός στελεχών στο ίδιο τρόφιμο και τη διαφορετική ικανότητα του καθενός από αυτά να ανταπεξέλθει και να ανταγωνιστεί κάτων από διαφορετικές συνθήκες (εμπλουτισμός vs ΑΓΟ).