Μελέτη της οικολογίας και των μηχανισμών δράσεως βακτηρίων της ριζόσφαιρας, ανταγωνιστικών εναντίον φυτοπαθογόνων μυκήτων και βακτηρίων

Abstract

The development of biological control methods against soilborn pathogens is among others based on the searching, evaluating and using of non-pathogenic rhizoshere bacteria. In parallel, the antagonistic action of these bacteria may be exercised against foliar pathogens. This research work deals with the ecology of two rhizosphere bacterial isolates able to control physiological races of Fusarium oxysporum and Vertcillium dahliae, both in vitro and in planta successfully. They are a Paenibacillus sp. (K-165) and a Bacillus sp. (5-127) isolates. The ecology, the duration of survival and the site of not colonisation in soil and into the plant were studied by using the polymerase chain reaction (PCR). Particularly, PCR technique was used to amplify the 16S-23S rRNA interspace region of both strains, by the use of universal primers, and then the nucleotide sequences of the amplified interspace region was determined. Afterwards, the alignment of the strains between other that was already registered in EMBL/GenBank was accomplished and gave as the opportunity to design a set of primer specific for each strain. The PCR technique was applied to chromosomal DNA isolated from natural non-sterile soil inoculated with our strains, using the set of the specific primers. By that technique the detection of as low as 2x10² bacterial cells per grammar of soil was achieved. One of the aims of this work was to study the modes of action of the aforementioned antagonistic bacterium K-165. So, we tried to investigate its capacity to induce resistance against the wiltpathogen Fusarium oxysporum f.sp. raphani (For) and the foliar pathogen Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 (Pst). Arabidopsis plants ecotype Col-0 (wild type), mutants etr-1 (ethylene response mutant), npr-1 (non expressed PR-proteins), jar-1 (jasmonate response mutant) and the trangenic NahG (that cannot accumulate salicylic acid) were individually sown in 1 ml pipette tips filled with sterile quartz sand in order to stimulate root elongation, removed after two weeks and placed vertically on a system of rock wool cubes consisting of two spatially separated compartments dividing the root system from the upper part of the plant. Three weeks after inoculation with For, symptoms were already developed in the control plants. Symptom severity expressed as percentage of diseased leaves, reached 56% in control plants 29 days after Fusarium inoculation and at the same time bacterial treatment restricted symptom expression down to 20%. At the end of the experiment (37 days after inoculation) Fusarium wilt symptoms reached almost 90% in control untreated Col-0 plants while in the bacterized ones were only 57%. As far as the etr-1, jar1 mutants and NahG trangenic plants are concerned, the percentage differences of symptom severity between the treated and untreated plants reached the 30%, 36% and 26%, respectively. On the contrary, the analysis of the results from the npr1 Arabidopsis mutant experiment didn't show any significant differentiation between treated and untreated plants with K-165. The npr1l mutants, based on impaired systemic acquired resistance (SAR) expression, reduced SA-induced PR gene expression and enhanced disease susceptibility, indicating the broad involvement of NPR1 regulator protein in plant defense. The absence of induced resistance at the npr1 mutants showed that the induced resistance that caused by the K-165 depends on NPR1 protein. For the Arabidopsis-Pst bioassay, seeds of Col-0 plants were sown and soil mixture was mixed with a 5x10⁷ cfu/g of K-165. Five-week-old plants were challenge inoculated with the virulent pathogen Pst by dipping the leaves in a dense bacterial suspension (2.5x10⁷ cfu/ml). Plants treated with K-165 strain against Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 showed a clear differentiation between treated and untreated plants, proving that K-165 also induces resistance against a bacterial pathogen. cDNA fragments of the ISR involved genes PR-1, PR-2, PR-5, Hel, Atvsp, and Tub were amplified with PCR, subcloned and sequenced. Leaf tissues were harvested at different days after inoculation with Pst, for RNA analysis. Gene expression was analysed by RT-PCR. The RT-PCR results showed that these genes are potentiated, leading to enhanced expression after challenge inoculation with Pst and that PR genes played a crucial role in the development of induced resistance. In this case it could be concluded that pathogen-induced systemic resistance is associated with potentiation of PR genes. The results for both of the experiments with the biocontrol bacterium K-165 against the root pathogen Fusarium oxysporum f.sp. raphani (For) and the leaf pathogen Pseudomonas syringae pv tomato (Pst) showed us that the pathogenesis- related proteins are responsible for the induced resistance for the host-pathogen-biocontrol agent system.

Η ανάπτυξη μεθόδων βιολογικής καταπολέμησης εδαφογενών παθογόνων, στηρίζεται μεταξύ άλλων στην αναζήτηση, αξιολόγηση και χρησιμοποίηση ανταγωνιστικών βακτηρίων της ριζόσφαιρας. Παράλληλα όμως η ανταγωνιστική δράση αυτών των βακτηρίων δύναται να εξασκηθεί και εναντίον παθογόνων τις φυλλόσφαιρας. Η εργασία αυτή αφορά στην οικολογία δύο στελεχών ριζοσφαιρικών βακτηρίων τα οποία ανταγωνίζονται επιτυχώς in vitro και in planta φυσιολογικές φυλές των μυκήτων Fusarium oxysporum και Vericillium dahliae. Πρόκειται για ένα βακτήριο του γένους Paenibacillus sp. (στέλεχος Κ-165) και ένα Bacillus sp. (στέλεχος 5-127). Η μελέτη της οικολογίας, της διάρκειας επιβίωσης και ο εντοπισμός των βακτηρίων στο έδαφος και στο φυτό, πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της τεχνικής της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Για το σκοπό αυτό υποκλωνοποιήθηκε η συντηρημένη περιοχή του γονιδιώματος ανάμεσα στο 23S και 16S rRNA (ενδοριβοσωμική περιοχή), με τη χρήση καθολικών εκκινητών. Ακολούθησε προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας για κάθε ένα στέλεχος και σύγκριση αυτών μεταξύ τους και μεταξύ άλλων καταχωρημένων στο διαδίκτυο ακολουθιών. Η σύγκριση αυτή επέτρεψε την εύρεση μη συντηρημένων και μοναδικών αλληλουχιών για το κάθε στέλεχος, γεγονός που οδήγησε στον σχεδιασμό εξειδικευμένων εκκινητών για κάθε ένα βακτηριακό στέλεχος. Παράλληλα, αναπτύχθηκε η μεθοδολογία για την απομόνωση γενωματικού βακτηριακού DNA από φυσικό έδαφος μολυσμένο με γνωστή συγκέντρωση κυττάρων των βακτηρίων μας. Απεδείχθη ότι η τεχνική PCR είναι δυνατόν να ανιχνεύσει την παρουσία DNA βακτηρίων των οποίων η συγκέντρωση μπορεί να περιοριστεί μέχρι και 2x102 κύτταρα ανά γραμμάριο ξηρού βάρους εδάφους. Στα πλαίσια της μελέτης του τρόπου δράσεως του ανταγωνιστικού ριζοβακτηρίου Κ-165, μελετήθηκε η δυνατότητα επαγωγής διασυστηματικής αντοχής από το στέλεχος αυτό κατά του παθογόνου μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. raphani, όπου ως φυτά-πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν φυτά Arabidopsis thaliana αγρίου τύπου Col-0, μεταλλαγμένα etr-1 (δεν παράγουν αιθυλένιο), jar-1 (δεν παράγουν το γιασμονακό οξύ), npr-1 (δεν επάγουν την παράγωγη πρωτεϊνών που σχετίζονται με την παθογένεση, PRs) και διαγονιδιακά NahG (δεν παράγουν σαλικυλικό οξύ). Για την επαγωγή της διασυστηματικής αντοχής τα φυτά αναπτύχθηκαν σε πετροβάμβακα με τέτοιον τρόπο ώστε να διαχωρίζεται το ριζικό σύστημα από το υπέργειο τμήμα, και πραγματοποιήθηκε εφαρμογή του ανταγωνιστικού παράγοντα σε μορφή ταλκ. Πέντε μέρες αργότερα ακολούθησε μόλυνση των φυτών με το μύκητα. Τα ανοσοποιημένα φυτά περιόριζαν την εμφάνιση συμπτωμάτων μέχρι και 50% συγκρινόμενα με το μάρτυρα, 30 μέρες μετά τη μόλυνση, τόσο στα φυτά αγρίου τύπου Col-0, όσο και στα etr-1, jar-1 και NahG. Όσον αφορά στα μεταλλαγμένα npr-1 δεν παρατηρήθηκε ανοσοποίηση στα φυτά που υπέστησαν εφαρμογή του ανταγωνιστικού βακτηρίου Κ-165. Το γεγονός αυτό μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η επαγωγή ανθεκτικότητας που προκαλείται από το Κ-165 ριζοβακτήριο, συνδέεται με την έκφραση γονιδίων PR. Τα μεταλλαγμένα npr-1 φυτά Arabidopsis έχουν επιλεχθεί για τη μελέτη των γονιδίων της επίκτητης διασυστηματικής αντοχής (SAR), τα οποία εγκλείονται στο μονοπάτι που οδηγεί από το σαλικυλικό οξύ στην ενεργοποίηση των γονιδίων των πρωτεϊνών PR. Τα φυτά αυτά έχουν υποστεί μετάλλαξη στο γονίδιο nrp1, δεν εκφράζουν τις πρωτεΐνες παθογένεσης και δεν εκδηλώνουν το φαινόμενο της SAR. Το npr1 γονίδιο κωδικοποιεί σε μια ρυθμιστική πρωτεΐνη, την NPR1, η οποία ενεργεί στο τελικό μέρος της μεταφοράς του σήματος στην επίκτητη διασυστηματική αντοχή. Τα δεδομένα του πειράματος αυτού αποδεικνύουν ότι η διασυστηματική αντοχή των φυτών που οφείλεται στο Κ-165 εξαρτάται από την παρουσία της πρωτεΐνης NPR1. Για την περαιτέρω μελέτη του τρόπου της επαγωγής αντοχής από το Κ-165 διερευνήθηκε η ικανότητα επαγωγής ανθεκτικότητας σε φυτά Arabidopsis, μετά από εφαρμογή του βακτηρίου Κ-165, εναντίον σημαντικών βακτηριολογικών ασθενειών του φυλλώματος (Pseudomonas syringae pv tomato) με σκοπό τον έλεγχο της ικανότητας επαγωγής του φαινομένου της ανοσοποίησης σε περισσότερα διαφόρου φύσεως παθογόνα και παθογόνων της φυλλικής επιφάνειας των φυτών αυτών. Ακολούθησε μοριακή διερεύνηση της έκφρασης γονιδίων τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι της επαγόμενης διασυστηματικής αντοχής ( ISR και SAR ) με σκοπό τον πιθανό εντοπισμό του αιτίου της διέγερσης (επαγωγής) των λανθανόντων μηχανισμών αντοχής του φυτού ενάντια στο παθογόνο. Υποκλωνοποιήθηκαν τμήματα των αμυντικών γονιδίων PR-1, PR-2, PR-5, AtVsp, Hel και Pdfl.2, και έγινε ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τους. Για τη μελέτη των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων αυτών εφαρμόστηκε η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης, με μήτρα μόρια mRNA (RT-PCR). Για την πραγματοποίηση των αντιδράσεων σχεδιάστηκαν εξειδικευμένοι εκκινητές για κάθε ένα γονίδιο, και ως RNA μήτρα συλλέχθηκε RNA από τη φυλλική επιφάνεια μολυσμένων φυτών Arabidopsis με το παθογόνο βακτήριο τα οποία είχαν υποστεί επέμβαση του ανταγωνιστικού βακτηρίου Κ-165. Τα αποτελέσματα του πειράματος αυτού αποδεικνύουν ότι παρατηρείται διαφοροποίηση στην έκφραση των PR γονιδίων, γεγονός το οποίο οδηγεί στο συμπέρασμα ότι οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με την παθογέγεση αποτελούν καθοριστικό παράγοντα για την επαγωγή ανθεκτικότητας στα φυτά με το βακτήριο Κ-165. Τα αποτελέσματα αμφοτέρων των πειραμάτων ανοσοποίησης με το βακτήριο Κ-165, έναντι του μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. raphani και έναντι του παθογόνου βακτηρίου της φυλλικής επιφάνειας Pseudomonas syringae pv tomato, οδηγούν στην άποψη ότι οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με την παθογένεση (PRs) ευθύνονται για την επαγωγή ανθεκτικότητας στο σύστημα ξενιστή-παθογόνου-βιολογικού παράγοντα, το οποίο μελετήθηκε στην παρούσα διατριβή.