Φυτοπαθολογική και μοριακή διερεύνηση της αλληλεπίδρασης του μύκητα Verticillium dahliae με το φυτό ξενιστή

Abstract

The present study deals with molecular mechanisms underpinning Verticillium dahliae pathogenicity. For that purpose the role of the G protein β subunit (Gb) and the Protein kinase A (PKA) genes that are implicated in signal transduction, the sucrose non fermenting gene (SNF) that regulates the induction of cell wall degrading enzymes and the gene VdNEP coding for a necrosis and ethylene inducing protein, were explored. Moreover, the possibility to induce RNA gene silencing of the endogenous Gb gene and the gfp transgene in V. dahliae was investigated. Individual disruption of the genes Gb, PKA and SNF1 through gene replacement caused reduction of the mutant’s pathogenicity on appropriate hosts. This reduction in pathogenicity was more drastic when the Gb or the SNF1 genes were disrupted, as the mutants were hardly virulent. In contrast, introduction of the VdNEP overexpression cassette under the control of a strong promoter increased virulence. Moreover, disruption of the Gb or PKA genes caused induction of microsclerotia production, an increase in germination and a decrease of ethylene production in disruption mutants compared to the wild type strain, which was higher in 70ΔGb than in 70ΔΡΚΑ mutants. In addition, 70ΔGb mutants grew in a perpendicular way. Overexpression of PKA in 70ΔGb mutant, restored the radial wild type growth and mutants were unable to produce sclerotia. Concerning RNA silencing in V. dahliae, a dsRNA expression construct of the Gb gene and three constructs of the afp (green fluorescent protein) marker gene under the control of different promoters were introduced in V. dahliae genome. However, none of the constructs were effective in inducing RNA gene silencing. The three afp hairpins caused a small reduction of afp fluorescence, when they were introduced in Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Analysis of the transcription level of the afp gene and the hairpin constructs in both fungi is required to clarify the RNAi mechanism in Verticillium dahliae.

Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκαν μοριακοί μηχανισμοί που σχετίζονται με την παθογένεια του μύκητα Verticillium dahliae. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκαν τα γονίδια της β υπομονάδας της πρωτεΐνης G (Gb) και της πpωτεϊvικής κινάσης Α (ΡΚΑ) που συμμετέχουν στη μετάδοση σήματος, το γονίδιο της πρωτεϊνικής κινάσης μη καταβολισμού της σακχαρόζης SNF1 που ελέγχει την επαγωγή υδρολυτικών ενζύμων στο μύκητα και το γονίδιο της πρωτεάσης VdNEP που προκαλεί νέκρωση και επαγωγή αιθυλενίου στο φυτό ξενιστή. Επίσης διερευνήθηκε η δυνατότητα επαγωγής RNA σίγησης του ενδογενούς γονιδίου Gb και του διαγονιδίου afp στον V. Dahliae. Απενεργοποίηση με γονιδιακή αντικατάσταση μεμονωμένα των γονιδίων Gb. ΡΚΑ και SNF1 προκάλεσε υειωση της παθογένειας σε κατάλληλους ξενιστές, η οποία ήταν πιο δραστική στην περίπτωση των γονιδίων Gb ή SNF1, όπου τα μεταλλαγμένα στελέχη ήταν ελάχιστα μολυσματικά. Αντίθετα, ενσωμάτωση της κασέτας υπερέκφρασης του γονίδιου VdNEP υπό τον έλεγχο ισχυρού υποκινητή, αύξησε την μολυσματική ικανότητα. Απενεργοποίηση των γονίδιων Gb ή ΡΚΑ προκάλεσε επίσης επαγωγή σχηματισμού σκληρωτικών, αύξηση στην βλαστικότητα και μείωση στην παράγωγη αιθυλενίου σε σχέση με το άγριο στέλεχος, η οποία ήταν μεγαλύτερη στα στελέχη 70ΔGb από τα 70ΔΡΚΑ. Επιπλέον απενεργοποίηση του γονίδιου Gb προκάλεσε κάθετη ανάπτυξη των υφών. Υπερέκφραση του γονίδιου ΡΚΑ σε στελέχη 70ΔGb, επανέφερε την ακτινωτή ανάπτυξη άγριου τύπου και προκάλεσε αδυναμία σχηματισμού σκληρωτικών. Σχετικά με την επαγωγή RNA σίγησης στον V. dahliae ενσωματώθηκε μια κατασκευή έκφρασης δίκλωνου RNA του γονίδιου Gb και τρεις κατασκευές του γονίδιου αναφοράς afp υπό τον έλεγχο διαφορετικών υποκινητών στο γονιδίωμα afp στελέχους. Ωστόσο, καμία από τις κατασκευές δεν ήταν αποτελεσματική στην επαγωγή RNA σίγησης στον V. Dahliae. Οι τρεις afp φουρκέτες προκάλεσαν επίσης μικρή μείωση του afp φθορισμού στον Fusarium oxysporum f. sp. Dianthi. Απαιτείται ανάλυση της μεταγραφής του γονίδιου afp και των κατασκευών φουρκέτας σε στελέχη και των δύο μυκήτων για διευκρίνιση του μηγανισμού RNAi.