Ο ρόλος των επιγενετικών επιδράσεων στη διαφοροποίηση των στελεχιαίων προγονικών κυττάρων του κεντρικού νευρικού συστήματος σε συνθήκες φλεγμονής

Abstract

Neural precursor cells (NPCs) constitute a valuable cell population of the central nervous system (CNS) due to their ability to self-renew and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. NPC transplantation therapies are used in a variety of neurodegenerative diseases, which are characterized by acute or chronic inflammation. However, the impact of inflammatory environment on NPCs biology has not been thoroughly studied. Interplay between environmental cues and gene regulation is achieved through epigenetic alterations, including DNA methylation and histone modifications. In this context, the present study aims to investigate the influence of inflammatory cytokines on the differentiation potential and the epigenetic profile of postnatally isolated NPCs (piNPCs) from mouse cerebral hemispheres.Initially, we identified the immunophenotype of undifferentiated piNPCs with flow cytometric analysis. piNPCs were positive for CD24, CD44, and CD133 though negative for CD15, CD184, and CD49d. Furthermore, we stimulated piNPCs with pro- or anti-inflammatory cytokines and analyzed their immunophenotype, and their differentiation. piNPCs stimulation with pro-inflammatory cytokines elevated the expression of CD44, CD24, CD49d, MHC class I and II. Pro- and anti-inflammatory cytokines differentially affected mRNA and protein expression of differentiation markers. IFNγ and TNFα induced the expression of proneural bHLH genes and neuronal markers, while reduced the expression of glial markers. Instead, TGFβ repressed the expression of glial and neuronal markers and maintained the undifferentiated state of piNPCs.We further examined changes on the epigenetic profile of cytokine-treated piNPCs. In particular, we studied gene expression levels of epigenetic mediators, levels of global histone acetylation and DNA methylation pattern of differentiation-associated genes. Cytokines induced dysregulated expression of genes encoding epigenetic enzymes. In addition, western blot analysis showed reduced histone H3 acetylation levels after IFNγ treatment, while TNFα increased histone H4 acetylation and TGFβ caused the opposite effect on histone H3 and H4 acetylation. Finally, bisulfite sequencing revealed altered DNA methylation pattern of Neurogenin-1 and betaIII-tubulin, indicating that IFNγ, TNFα regulate gene transcription through epigenetic mechanisms.Our results indicate that piNPCs are characterized by a unique immunophenotype. Distinct inflammatory factors seem to affect differentially piNPCs differentiation acting through epigenetic mechanisms. Further investigation of epigenetic regulation would be critical for clinical application of NPC-based therapies.

Τα Στελεχιαία Προγονικά Κύτταρα (ΣΠΚ) αποτελούν βασικό κυτταρικό πληθυσμό του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) καθώς διατηρούν την ικανότητα να αυτό-ανανεώνονται και να διαφοροποιούνται προς νευρώνες και γλοία. Εξαιτίας των ιδιοτήτων τους, τα ΣΠΚ μελετώνται ως θεραπευτικές προσεγγίσεις σε νευροεκφυλιστικές παθήσεις, κοινό χαρακτηριστικό των οποίων αποτελεί η φλεγμονώδης διαδικασία. Ωστόσο, δεν έχει μελετηθεί εκτενώς η επίδραση της φλεγμονής στη βιολογία των ΣΠΚ. Σε παθολογικές καταστάσεις οι επιγενετικές τροποποιήσεις κατευθύνουν τη γονιδιακή έκφραση στα ΣΠΚ αποκρινόμενες σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα, διαδραματίζοντας ουσιώδη ρόλο στην παθογένεια. Σε αυτό το πλαίσιο, η παρούσα διατριβή εστιάζει στη διερεύνηση της επίδρασης των φλεγμονωδών κυτταροκινών, στη διαφοροποίηση των ΣΠΚ και το επιγενετικό τους προφίλ.Αρχικά, ταυτοποιήθηκε ο ανοσοφαινότυπος των ΣΠΚ μεταγεννητικού εγκεφάλου μυών, με κυτταρομετρία ροής. Τα αδιαφοροποίητα ΣΠΚ εκφράζουν τους δείκτες CD44, CD24 και CD133, αλλά όχι τους CD15, CD49d και CD184. Έπειτα, τα ΣΠΚ καλλιεργήθηκαν παρουσία κυτταροκινών και εξετάστηκαν οι αλλαγές στον ανοσοφαινότυπο, στο πρότυπο διαφοροποίησης και στο επιγενετικό τους προφίλ. Η έκφραση των αντιγόνων CD44, CD24, CD49d και των μορίων MHC αυξήθηκε μετά από επώαση των ΣΠΚ με IFNγ και TNFα. Η διέγερση των ΣΠΚ με προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες ή τον TGFβ, προκάλεσε διαφορικό πρότυπο διαφοροποίησης στην κάθε πειραματική ομάδα. Οι IFNγ και TNFα αύξησαν την έκφραση των δεικτών νευρογένεσης, ενώ κατέστειλαν την έκφραση γλοιακών δεικτών. Αντίθετα, ο TGFβ διατήρησε τα ΣΠΚ σε αδιαφοροποίητη κατάσταση, ρυθμίζοντας ταυτόχρονα αρνητικά την έκφραση δεικτών νευρογένεσης και γλοιογένεσης. Η διαφορική επίδραση των προφλεγμονωδών κυτταροκινών και του TGFβ ήταν επίσης φανερή στο επιγενετικό προφίλ. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τα επιγενετικά ένζυμα παρουσίασαν απορρυθμισμένο πρότυπο έκφρασης. Επίσης, το ανοσοστύπωμα κατά Western έδειξε ότι τα επίπεδα ακέτυλο-ιστόνης Η3 μειώθηκαν λόγω της IFNγ, ο TNFα προκάλεσε αύξηση της ακετυλιωμένης ιστόνης Η4, ενώ ο TGFβ φαίνεται να προκάλεσε αντίθετα αποτελέσματα στις ακέτυλο-ιστόνες Η3 και Η4. Τέλος, με αλληλούχηση του DNA αποδείχθηκε ότι τα γονίδια Ngn1 και Tubb3 είχαν διαφορικό πρότυπο μεθυλίωσης του DNA μετά από την επίδραση των προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών.Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι τα μεταγεννητικά ΣΠΚ διαθέτουν μοναδικό ανοσοφαινότυπο. Η έκθεσή τους σε προ- ή αντι-φλεγμονώδεις παράγοντες τα κατευθύνει προς διαφορετική κυτταρική μοίρα και οι αλλαγές αυτές φαίνεται να επιτελούνται μέσω επιγενετικών τροποποιήσεων. Η περαιτέρω μελέτη της επιγενετικής ρύθμισης των ΣΠΚ in vivo θα μπορούσε να συμβάλλει στην εύρεση νέων θεραπευτικών στόχων.