Νέες προσεγγίσεις στη φυτοχημική ανάλυση: ανάπτυξη μεθόδων ποσοτικού προσδιορισμού, ελέγχου αυθεντικότητας και εκτίμησης βιοδραστικότητας δευτερογενών μεταβολιτών με τη χρήση σύγχρονων τεχνικών ενόργανης ανάλυσης και χημειομετρίας

Abstract

In this thesis, new methods were initially developed for the quantification of selected biologically active secondary metabolites, such as pulegone, a monoterpene ketone occurring primarily in the essential oil of the plant Mentha pulegium L. (pennyroyal), as well as the organosulfur compounds alliin and methiin, which represent the major S-alk(en)yl-L-cysteine sulfoxides identified in bulbs of Allium sativum L. (garlic).More specifically, pulegone constitutes a controversial ingredient in foods, beverages, or cosmetics mainly due to its relevance to human toxicity when present at high concentrations. As a matter of fact, the European Commission has set maximum permitted levels for pulegone content in different categories of foods and beverages. The direct and rapid quantification of pulegone in its key source, pennyroyal essential oil, was achieved by means of Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy combined with partial least squares (PLS) regression. The samples used for evaluating the calibration model developed were mainly essential oils obtained from different Greek pennyroyal populations by hydrodistillation, using a Clevenger-type apparatus. The pulegone content ranged from 157 to 860 mg/mL. The proposed method that utilizes spectroscopic data from the region 1650-1260 cm-1 showed equivalent results to those obtained when using the standard gas chromatographic method (GC-FID), as demonstrated by the statistical F and t tests.Alliin and methiin act as precursors for a wide range of bioactive molecules in garlic. For the determination of these compounds, new methods were developed at first using hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) coupled with photodiode array (PDA) or mass spectrometry - electrospray ionization (ESI-MS) detection. Response surface methodology (RSM), through central composite design (CCD), was employed to optimize the conditions of both methods; the factors investigated were the pH value and the proportion (%) of acetonitrile/water in the mobile phase. The analysis of garlic samples of diverse origin was performed using the methanolic extracts obtained. Subsequently, a new method was developed using diffuse reflectance infrared Fourier transform spectroscopy (DRIFTS) and multivariate analysis of spectroscopic data, which appeared to be an alternative for the quantification of alliin and methiin in methanolic garlic extracts. The reference values used to develop PLS calibration models were determined by using liquid chromatography.The development of new methods for saffron authentication followed. Saffron, the dried red stigmas of Crocus sativus L., comprises the most expensive spice in the global market and thereby is among the major candidates for economically motivated adulteration. The first study was based on metabolite fingerprinting by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy with a view to detecting saffron adulteration with characteristic plant-derived materials, including C. sativus stamens, Carthamus tinctorius L. petals (safflower), Curcuma longa L. powdered rhizomes (turmeric), and Gardenia jasminoides Ellis fruit extract (gardenia). 1H NMR spectra of pure and adulterated saffron samples were acquired from the corresponding DMSO-d6 extracts. The supervised classification models built by using orthogonal projection to latent structures - discriminant analysis (OPLS-DA) and its bidirectional modification (O2PLS-DA) indicate that untargeted 1H NMR metabolite fingerprinting and chemometrics enable the reliable detection and identification of plant-derived adulterants at a minimum level of 20% (w/w). In the next study, the use of DRIFTS in conjunction with multivariate classification and calibration techniques resulted in an integrated analytical approach for assessing saffron adulteration with bulking agents of plant origin. In addition to the aforementioned materials, Calendula officinalis L. petals (calendula) and Buddleja officinalis Maxim. flower bud extract (buddleja) were also examined. The first step was to develop a classification model capable of detecting saffron adulteration with the six plant-derived materials, by making use of mid-infrared fingerprints (4000-600 cm-1). The second classification model was developed using spectroscopic data from the region 2000-600 cm-1, where most critical variations based on the absorptions of characteristic secondary metabolites of adulterants occur. This model allowed adulterant identification with high sensitivity down to levels of 5% (w/w). In both cases, the supervised pattern recognition method used was partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). For the quantification of each plant-derived adulterant in adulterated samples, PLS models were built in the concentration range 0-20% (w/w). The calibration models were optimized through variable selection by synergy interval PLS (siPLS) method. The overall performance of the PLS/siPLS models as well as the detection limits determined, which ranged from 1.0 to 3.1% (w/w), highlight the practical suitability of the proposed methodology for tackling fraud issues with adulterants of plant origin.Furthermore, saffron adulteration with Sudan I-IV dyes was investigated. The use of these synthetic azo-compounds in food production is banned in most countries, including the European Union, due to their potential carcinogenicity. For this purpose, a new approach using high resolution 1H NMR spectroscopy is introduced. As shown in this study, different signals of aromatic protons can be considered for the identification of each of the Sudan I-IV dyes in adulterated saffron, which can then be utilized for quantitative 1H NMR (qHNMR). The quantification of Sudan III, as a representative example of Sudan family, was performed in varying levels of adulteration (0.14-7.1 g/kg) by taking into account the NMR signal occurring at 8.064 ppm. The high linearity, accuracy and rapidity of analyses indicate the capability of this 1H NMR-based method to assess adulteration of saffron with Sudan dyes.The findings presented in the final chapter illustrate that FT-IR spectroscopy can be a valuable, non-destructive technique for investigating the biological activity of various terpenoids against mosquito larvae of Culex pipiens L. According to the FT-IR spectra recorded, specific absorption bands of characteristic intensities are attributed to the presence of functional groups that may determine the bioactivity of molecules with similar structure. After in vitro evaluation of the toxic action of terpenoids, LC50 and LC90 values were used as reference in order to develop PLS models for predicting the larvicidal activity.

Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής αρχικά αναπτύχθηκαν νέες μέθοδοι για τον ποσοτικό προσδιορισμό επιλεγμένων δευτερογενών μεταβολιτών με βιολογικό ενδιαφέρον, όπως το μονοτερπένιο πουλεγόνη, που απαντά κυρίως στο αιθέριο έλαιο του φυτού Mentha pulegium L. (κοινώς φλισκούνι), και οι οργανοθειούχες ενώσεις αλλιίνη και μεθιίνη, οι οποίες αποτελούν τα σημαντικότερα σουλφοξείδια της S-αλκ(εν)υλo-L-κυστεΐνης που εντοπίζονται στους βολβούς του φυτού Allium sativum L. (κοινώς σκόρδο). Πιο αναλυτικά, η πουλεγόνη αποτελεί αμφιλεγόμενο συστατικό τροφίμων, ποτών και καλλυντικών, εξαιτίας της τοξικότητας που μπορεί να προκαλέσει στον άνθρωπο σε υψηλές συγκεντρώσεις. Για το λόγο αυτό, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή έχει καθορίσει ανώτατα επιτρεπτά όρια περιεκτικότητας σε πουλεγόνη για επιμέρους κατηγορίες τροφίμων και ποτών. Προκειμένου να καταστεί εφικτή η άμεση και γρήγορη ποσοτικοποίηση της πουλεγόνης στο φυσικό προϊόν που αποτελεί βασική της πηγή, το έλαιο από φλισκούνι, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος με τη χρήση της φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FT-IR) σε συνδυασμό με την παλινδρόμηση μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS). Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της μεθόδου ήταν, κατά κύριο λόγο, αιθέρια έλαια που παραλήφθηκαν από ξηρή δρόγη φυτικών δειγμάτων διαφορετικών πληθυσμών της Ελλάδας με τη μέθοδο της υδροαπόσταξης σε συσκευή Clevenger. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η προτεινόμενη μέθοδος που βασίστηκε στα φασματοσκοπικά δεδομένα της περιοχής 1650-1260 cm-1 αποδείχθηκε ισοδύναμη, βάσει των στατιστικών ελέγχων F και t, με την αεριοχρωματογραφική μέθοδο αναφοράς (GC-FID) για εύρος συγκεντρώσεων πουλεγόνης από 157 έως 860 mg/mL. Η αλλιίνη και η μεθιίνη αποτελούν πρόδρομες ενώσεις πλήθους βιοδραστικών μορίων του σκόρδου. Για τον ποσοτικό τους προσδιορισμό αναπτύχθηκαν, σε πρώτη φάση, νέες μέθοδοι με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων (HILIC) συζευγμένης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (PDA) ή φασματομετρίας μαζών - ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό (ESI-MS). Η μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης (RSM), μέσω του κεντρικού σύνθετου σχεδιασμού (CCD), χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών των δύο μεθόδων, με παράγοντες την τιμή pH και την αναλογία (%) ακετονιτριλίου/νερού στην κινητή φάση. Η ανάλυση σε δείγματα σκόρδου διαφορετικής προέλευσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα μεθανολικά εκχυλίσματα που παραλήφθηκαν. Με τη χρήση της φασματοσκοπίας FT-IR με την τεχνική της διάχυτης ανάκλασης (DRIFTS) και της πολυμεταβλητής ανάλυσης φασματοσκοπικών δεδομένων αναπτύχθηκε μια εναλλακτική μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού της αλλιίνης και της μεθιίνης στα μεθανολικά εκχυλίσματα από δείγματα σκόρδου. Για την ανάπτυξη των στατιστικών μοντέλων παλινδρόμησης με τη μέθοδο PLS, χρησιμοποιήθηκαν ως τιμές αναφοράς οι συγκεντρώσεις που προσδιορίστηκαν με υγρή χρωματογραφία.Στη συνέχεια της διατριβής πραγματοποιήθηκε ο έλεγχος αυθεντικότητας στα στίγματα του κρόκου (Crocus sativus L.), που συνιστούν το ακριβότερο άρτυμα στην παγκόσμια αγορά και επομένως έναν από τους επικρατέστερους στόχους για νοθεία. Η πρώτη μελέτη βασίστηκε στη χημειομετρική ανάλυση του αποτυπώματος των μεταβολιτών που καταγράφηκε με τη φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίου (1H NMR), με σκοπό την ανίχνευση νοθείας του κρόκου με χαρακτηριστικά φυτικά υλικά, όπως οι στήμονες του φυτού C. sativus, τα πέταλα κάρθαμου (Carthamus tinctorius L.), ο κουρκουμάς (Curcuma longa L.) και το εκχύλισμα των καρπών γαρδένιας (Gardenia jasminoides Ellis). Για τη λήψη των φασμάτων 1H NMR χρησιμοποιήθηκαν εκχυλίσματα αυθεντικών και νοθευμένων δειγμάτων κρόκου σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO-d6). Τα μοντέλα επιβλεπόμενης ταξινόμησης που αναπτύχθηκαν μέσω διαχωριστικής ανάλυσης με ορθογώνια προβολή σε λανθάνουσες δομές (OPLS-DA, O2PLS-DA) υποδεικνύουν ότι μπορεί να γίνει αξιόπιστη εκτίμηση της ύπαρξης και του είδους νοθείας κατ’ ελάχιστο στο επίπεδο του 20% (w/w), μέσω της μη στοχευόμενης διερεύνησης του συνολικού αποτυπώματος μεταβολιτών που προκύπτει με 1H NMR. Με τη δεύτερη μελέτη, όπου χρησιμοποιήθηκαν η φασματοσκοπική τεχνική DRIFTS και χημειομετρικές τεχνικές ταξινόμησης και ποσοτικοποίησης, επιτεύχθηκε μια ολοκληρωμένη αναλυτική προσέγγιση της νοθείας του κρόκου με φυτικά υλικά. Εκτός των προαναφερθέντων υλικών νοθείας ελέγχθηκαν, επίσης, τα πέταλα καλέντουλας (Calendula officinalis L.) και το εκχύλισμα από άνθη του φυτού Buddleja officinalis Maxim. Στο πρώτο στάδιο αναπτύχθηκε ένα μοντέλο ανίχνευσης νοθείας με τα έξι επιμέρους φυτικά υλικά, κάνοντας χρήση ολόκληρου του φασματοσκοπικού αποτυπώματος (4000-600 cm-1). Για το δεύτερο μοντέλο ταξινόμησης αξιοποιήθηκαν τα δεδομένα της περιοχής 2000-600 cm-1, όπου εντοπίστηκαν οι σημαντικότερες διαφοροποιήσεις λόγω των απορροφήσεων χαρακτηριστικών δευτερογενών μεταβολιτών των υλικών. Η αναγνώριση του υλικού νοθείας στα νοθευμένα δείγματα υλοποιήθηκε με μεγάλη ευαισθησία, σε ελάχιστο ποσοστό 5% (w/w). Και στις δύο περιπτώσεις έγινε επιβλεπόμενη αναγνώριση προτύπων με διαχωριστική ανάλυση μέσω παλινδρόμησης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιμέρους υλικών στα νοθευμένα δείγματα, τα βέλτιστα μοντέλα PLS που προέκυψαν, για εύρος νοθείας 0-20% (w/w), βασίστηκαν στην επιλογή μεταβλητών από τα φασματικά διαστήματα που εμφάνισαν μέγιστη συνέργεια (siPLS). Η συνολική επίδοση των μοντέλων PLS/siPLS καθώς και τα όρια ανίχνευσης, τα οποία κυμάνθηκαν από 1.0 έως 3.1% (w/w), αναδεικνύουν το ιδιαίτερο πρακτικό ενδιαφέρον της μεθοδολογίας για την αντιμετώπιση περιπτώσεων νοθείας με υλικά φυτικής προέλευσης.Επιπλέον, μελετήθηκε η νοθεία του κρόκου με τις συνθετικές χρωστικές Sudan I-IV, οι οποίες είναι αζωχρώματα απαγορευμένα στις περισσότερες χώρες, συμπεριλαμβανομένης της Ευρωπαϊκής Ένωσης, για χρήση σε τρόφιμα λόγω πιθανής καρκινογένεσης. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε μια νέα προσέγγιση με τη χρήση της φασματοσκοπίας 1H NMR υψηλής διαχωριστικής ικανότητας. Όπως αποδείχθηκε, διαφορετικά σήματα πρωτονίων (1Η) αρωματικών δακτυλίων μπορούν να ληφθούν υπόψη για τον εντοπισμό καθεμίας από τις χρωστικές Sudan I-IV σε ενδεχόμενη νοθεία αυτού του τύπου στον κρόκο, τα οποία ακολούθως μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον ποσοτικό προσδιορισμό των χρωστικών με 1Η NMR (qHNMR). Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα αποτέλεσε η ποσοτικοποίηση του Sudan III που πραγματοποιήθηκε σε διάφορα επίπεδα νοθείας (0.14-7.1 g/kg), εξετάζοντας τη φασματική ταινία που εμφανίζεται σε χημική μετατόπιση 8.064 ppm. Η υψηλή γραμμικότητα, ακρίβεια και ταχύτητα των αναλύσεων έδειξαν πως η μέθοδος με φασματοσκοπία 1Η NMR είναι ικανή για τον έλεγχο της νοθείας του κρόκου με χρωστικές ουσίες της οικογένειας Sudan.Από τα ευρήματα της διατριβής προέκυψε, τέλος, ότι η φασματοσκοπία FT-IR μπορεί να αποτελέσει μια σημαντική, μη καταστρεπτική τεχνική για τη διερεύνηση της βιοδραστικότητας τερπενοειδών ενώσεων σε προνύμφες κουνουπιών του είδους Culex pipiens L. Σύμφωνα με τα φάσματα FT-IR που καταγράφηκαν, συγκεκριμένες ταινίες απορρόφησης χαρακτηριστικής έντασης οφείλονται στην ύπαρξη χαρακτηριστικών ομάδων που μπορούν να καθορίζουν τη δραστικότητα μορίων με ανάλογη δομή. Έπειτα από τον έλεγχο της τοξικής δράσης τερπενοειδών, προσδιορίστηκαν οι τιμές των θανάσιμων συγκεντρώσεων LC50 και LC90 που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη μοντέλων πρόβλεψης της εν λόγω δραστικότητας με τα φασματοσκοπικά δεδομένα FT-IR και τη μέθοδο PLS.