Διερεύνηση της ρύθμισης της έκφρασης του bHLH μεταγραφικού παράγοντα neurogenin2 και της μεθυλοτρανσφεράσης της αργινίνης PRMT8 στο νευρικό περιβάλλον

Abstract

The main goal of this thesis was to investigate the regulatory mechanisms governing the expression of transcription factors and epigenetic modulators which are involved in neurogenesis focusing on the arginine methyltransferase PRMT8, and the bHLH protein Ngn2. Histone methylation on arginine residues is a new mechanism implicated in the dynamic regulation of chromatin structure and epigenetic memory. It is mediated by specialized enzymes called PRMTs. PRMT8 is particularly interesting because it is expressed exclusively in the nervous system, however its putative role in the process of adult neurogenesis is yet unknown. A fundamental role in neurogenesis as well as in neural stem cell maintenance and cell fate determination is played by the bHLH family of transcription factors. One of the proneural genes of this family, and a crucial regulator of neurogenesis is Ngn2. Both the levels and the activity of Ngn2 are under strict control which is essential for the initiation of the differentiation process. However, the regulation of Ngn2 gene expression is still poorly understood. By analyzing the expression profile of PRMT8 in the adult mouse hippocampus, we showed that PRMT8 is localized solely in the nucleus of the mature NeuN+ neurons in the granular zone of the dentate gyrus, and is never expressed together with the early differentiation marker DCX. To investigate the role of PRMT8 in vivo, we generated retroviral vectors in order to overexpress or downregulate the protein in the neurogenic regions of the adult mouse brain. During these experiments we realized that the cDNA sequence which was annotated in the NCBI database, produced only the membrane-bound and not the nuclear form. By analyzing more extensively the 5’ end of the gene using cRACE or 5’ RLM-RACE, we identified several novel alternative transcripts. One of them differs from the established PRMT8 mRNA only in the first exon, and probably represents the nuclear isoform. We also investigated the regulation of Ngn2 gene expression during neuronal differentiation, using as models rat neural progenitor cells (NPCs) as well as human neuroblastoma cells. In the NPCs, the Ngn2 mRNA levels increase fast within the first three hours of differentiation, and then decrease rapidly to undetectable levels. In the neuroblastoma cells the Ngn2 mRNA increases gradually at the early stages of differentiation and then it remains at constantly low levels for the rest of the program. In low serum, but in the absence of RA which is essential for neuronal differentiation, the mRNA levels of Ngn2 rise dramatically and remain high, indicating that continuous presence of RA is important for the control of its steady state levels. By studying the changes in the protein profile of Ngn2, we noticed a disparity with the corresponding mRNA levels. Further analysis revealed that Ngn2 expression is also regulated at the level of translation and uncovered the presence of a negative feedback mechanism between Ngn2 and HuD, an RNA binding protein which can enhance or suppress the translation of its mRNA targets. The 5’-UTR of the Ngn2 mRNA seems to play a fundamental role in this mechanism, influencing not only the regulation of translation but also the interplay between Ngn2 and HuD. Overexpression experiments revealed that a small number of cells expressing Ngn2 can increase the expression of endogenous HuD in the total cell population, however, co-expression of the HMG family transcription factor Sox11 restricts the expression of HuD exclusively in the Ngn2+ cells, indicating that Ngn2 and Sox11 can synergize to control the expression of target genes. Analysis of the transcriptome profile (RNAseq) at distinct stages of neuronal differentiation in which the expression pattern of Ngn2 changes in a defined manner, resulted in the identification of several genes that provide a source for future studies in order to understand better the network of key regulators of neurogenesis whose expression is adjusted at multiple levels, such as Ngn2.

Στόχος αυτής της διατριβής ήταν η κατανόηση των μηχανισμών ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης επιγενετικών ρυθμιστών και μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στην πορεία της νευρογένεσης και συγκεκριμένα της μεθυλοτρανσφεράσης της αργινίνης PRMT8 και της πρωτεΐνης Ngn2. Η μεθυλίωση των ιστονών σε κατάλοιπα αργινίνης αποτελεί έναν νέο μηχανισμό δυναμικής ρύθμισης της χρωματινικής δομής, και επιτελείται από μια κατηγορία ενζύμων που ονομάζονται PRMTs. Η πρωτεΐνη PRMT8 παρουσιάζει ενδιαφέρον επειδή, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα μέλη, εκφράζεται αποκλειστικά στο νευρικό σύστημα αλλά ο ρόλος της στη διαδικασία της ενήλικης νευρογένεσης παραμένει άγνωστος. Θεμελιώδη ρόλο στη νευρογένεση, τη διατήρηση του δυναμικού των νευρικών βλαστικών κυττάρων και τον καθορισμό της κυτταρικής μοίρας παίζουν επίσης και οι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας bHLH. Ένα από τα προνευρικά γονίδια αυτής της οικογένειας που αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή της νευρογένεσης είναι το Ngn2. Τα επίπεδα και η ενεργότητα της Ngn2 βρίσκονται υπό αυστηρό έλεγχο ο οποίος είναι θεμελιώδης για την έναρξη της διαδικασίας διαφοροποίησης. Παρόλα αυτά η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης της Ngn2 δεν είναι καλά κατανοητή. Αναλύοντας το πρότυπο έκφρασης της PRMT8, δείξαμε ότι η PRMT8 συνεκφράζεται με την πρωτεΐνη NeuN η οποία εντοπίζεται στον πυρήνα των ώριμων νευρικών κυττάρων στην κοκκιώδη στοιβάδα της οδοντωτής έλικας, ενώ δεν συνεντοπίζεται με τον δείκτη DCX. Προκειμένου να διερευνήσουμε τον ρόλο της PRMT8 in vivo, κατασκευάσαμε πλασμιδιακούς φορείς με στόχο την παρασκευή ρετροϊών για την υπερέκφραση ή την καταστολή της πρωτεΐνης. Κατά τη διάρκεια αυτών των πειραμάτων, διαπιστώσαμε ότι το cDNA που είχαμε χρησιμοποιήσει και το οποίο αντιστοιχούσε στο mRNA που ήταν καταχωρημένο στη βάση δεδομένων, παρήγαγε μόνο τη μεμβρανική και όχι την πυρηνική μορφή. Μελετώντας αναλυτικότερα το 5’ άκρο του γονιδίου χρησιμοποιώντας τις μεθόδους cRACE ή 5’ RLM-RACE, ταυτοποιήσαμε μερικά εναλλακτικά μετάγραφα. Ένα από αυτά διαφέρει από τα μέχρι τώρα γνωστά και ενδεχομένως αντιπροσωπεύει την πυρηνική ισομορφή. Παράλληλα, διερευνήσαμε τα επίπεδα ρύθμισης της έκφρασης του γονιδίου Ngn2 κατά τη νευρική διαφοροποίηση, χρησιμοποιώντας ως μοντέλα πρόδρομα νευρικά κύτταρα (NPCs) από ιππόκαμπο ενήλικου επίμυος καθώς και ανθρώπινα νευροβλαστωματικά κύτταρα. Στα NPCs το γονίδιο εκφράζεται μέσα στις τρεις πρώτες ώρες της διαφοροποίησης, ενώ στη συνέχεια η έκφρασή του μειώνεται δραματικά. Στα νευροβλαστωματικά κύτταρα το mRNA αυξάνεται με προοδευτικό τρόπο κατά τη διαφοροποίηση και η έκφραση του διατηρείται σε σχετικά σταθερά και χαμηλά επίπεδα. Στις αντίστοιχες συνθήκες αλλά απουσία του RA που επάγει τη νευρική διαφοροποίηση, τα επίπεδα mRNA του γονιδίου είναι πολύ αυξημένα, επομένως η συνεχής παρουσία του RA είναι απαραίτητη για την ελεγχόμενη αύξηση του mRNA. Μελετώντας τις μεταβολές στο επίπεδο της πρωτεΐνης αντιληφθήκαμε μια αναντιστοιχία με τα αντίστοιχα επίπεδα του mRNA, η περαιτέρω διερεύνηση της οποίας μας έδειξε ότι εκτός από το επίπεδο της μεταγραφής, υπάρχει ένας ακόμη σημαντικός έλεγχος της έκφρασης του γονιδίου Ngn2 και στο επίπεδο της μετάφρασης και αποκάλυψε έναν μηχανισμό αρνητικής ανατροφοδότησης μεταξύ των επιπέδων της Ngn2 και της HuD, μιας πρωτεΐνης με ιδιότητες πρόσδεσης στο RNA, η οποία έχει την ικανότητα να ενισχύει ή να καταστέλλει τη μετάφραση των mRNA-στόχων. Στον μηχανισμό αυτό, σημαντικό ρόλο φαίνεται ότι έχει η 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή του Ngn2 mRNA τόσο για τη ρύθμιση της μετάφρασης όσο και για την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Ngn2 με την HuD. Πειράματα υπερέκφρασης φανερώνουν ότι ένας μικρός αριθμός κυττάρων που εκφράζουν Ngn2 μπορεί να επηρεάζει την έκφραση της HuD στον ευρύτερο κυτταρικό πληθυσμό ενώ η συνέκφραση του Sox11, της οικογένειας ΗΜG, περιορίζει την έκφραση της HuD αποκλειστικά στα Ngn2+ κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση των μεταγραφικών παραγόντων Ngn2 και Sox11 μπορεί να συντονίζει τη ρύθμιση της έκφρασης και άλλων γονιδίων-στόχων τους. Η ανάλυση του συνόλου των γονιδίων που μεταγράφονται (RNAseq), σε διακριτά στάδια της νευρικής διαφοροποίησης στα οποία το πρότυπο έκφρασης της Ngn2 μεταβάλλεται με καθορισμένο τρόπο αποκάλυψε μια συντονισμένη ρύθμιση της έκφρασης συγκεκριμένων ομάδων γονιδίων στην πορεία της διαφοροποίησης που αποτελεί πηγή για μελλοντικές μελέτες με στόχο την βαθύτερη κατανόηση του δικτύου κομβικής σημασίας ρυθμιστών της νευρογένεσης, που η έκφραση τους προσαρμόζεται σε πολλαπλά επίπεδα, όπως είναι το Ngn2.