Γενετική και επιγενετική ανταπόκριση ανθρωπίνων κυττάρων σε εξωγενείς παράγοντες

Abstract

In this study we investigated the effect of environmental stimuli to the normal development of an organism by regulating the genetic and epigenetic profile of molecules involved in the system of stress response. Our study was conducted on different experimental models in an effort to investigate the stress effects, both in vivo and in vitro.The main part of the study has focused on alterations of the expression and methylation pattern of molecules associated with the function of HPA axis in an experimental model of maternal deprivation. We concluded that Maternal Separation and Early Weaning (MSEW) lead to long-term changes, stimulating the HPA axis, with the glucocorticoid receptor changing considerably, both at the protein and transcription level, in an opposite way between hippocampus as oppose to amygdala. The epigenetic modification of UBE3A, in the DNA methylation level, confirms the transcriptional regulation of GR, while individual differences reveal the importance of the individual characteristics in the body's response to a stressful stimulus. Correspondingly, we investigated in vitro the role of glucocorticoids in the development of nerve cells, by studying the response of neuroblastoma cell lines to dexamethasone treatment. Our preliminary findings showed that the cells responded to different concentrations of the drug by cell cycle arrest, thereby launching further study of the glucocorticoid system at the cellular level. Additionally, our interest was focused on the investigation of the interaction of the endocannabinoid and corticosteroid systems, both associated with stress. The results reveal that the intravenous administration of exponentially elevating doses of Δ9-THC activates the HPA axis, by increasing the expression of GR, MR and UBE3A. To summarize, we suggest that the synthetic cannabinoid drug (Δ9-THC) can reduce the stress symptoms, since we observe opposite effects than those of maternal separation. Furthermore, we examined the role of mitochondria in the brain response to stress. The protein levels of the electron transport chain complexes and SLC25A22, NMDAR, Cyt C molecules, suggest that the anxiety phenotype is not associated with the mitochondial proteome. However, low anxiety levels seem to be associated with high calcium flow in the brain striatum cells. Finally, a large part of this thesis has focused on the investigation of the possible mechanism which activates osteogenesis during the application of mechanical stress on hAT-MSCs. This experiment was conducted in an effort to simulate the environment that promotes the development of ectopic ossification. We observed that the constant application of mechanical stress in the cell system promoted early osteogenesis and demethylation of the GNAS promoter regions. The complete understanding of the molecular mechanism may lead to the development of methods for the prevention or treatment of heterotopic ossification.The common aim of the individual parts of this study was to understand the mechanisms that regulate the response of an organism to environmental stimuli, with a view to contributing to the development of new treatments for disorders caused by stress.

Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η επίδραση περιβαλλοντικών ερεθισμάτων στη φυσιολογική ανάπτυξη ενός οργανισμού με τη ρύθμιση του γενετικού και επιγενετικού προφίλ μορίων που συμμετέχουν στην απόκριση στο στρες. Η μελέτη μας συμπεριέλαβε διαφορετικά πειραματικά μοντέλα στην προσπάθεια να διερευνηθεί η στρεσογόνος δράση σε συστήματα in vivo και in vitro. Το κύριο μέρος της εργασίας επικεντρώθηκε στις μεταβολές του προτύπου έκφρασης και μεθυλίωσης μορίων που συσχετίζονται με τη λειτουργία του άξονα ΗΡΑ σε ένα πειραματικό μοντέλο μητρικής αποστέρησης. Το γενικό συμπέρασμα ήταν ότι το στρες μητρικής αποστέρησης και ο πρόωρος απογαλακτισμός οδηγούν σε μακροπρόθεσμες μεταβολές που δείχνουν ευαισθητοποίηση του άξονα ΗΡΑ, με τον υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών να μεταβάλλεται σημαντικά, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και πρωτεΐνης, με αντίθετη τάση στον ιππόκαμπο απ’ ότι στην αμυγδαλή. Οι αλλαγές του προτύπου μεθυλίωσης του UBE3A, μιας πολύ σταθερής επιγενετικής τροποποίησης, επηρεάζει την έκφραση αυτού του γονιδίου, και κατά συνέπεια τη μεταγραφική ενεργότητα του GR, ενώ οι ατομικές διαφορές που παρατηρούνται αποκαλύπτουν τη σημασία του ατομικού παράγοντα στην απόκριση του οργανισμού στο στρεσογόνο ερέθισμα. Αντίστοιχα, διερευνήθηκε in vitro ο ρόλος των γλυκοκορτικοειδών στις ιδιότητες των νευρικών κυττάρων, μελετώντας την απόκριση κυττάρων νευροβλαστώματος στη χορήγηση δεξαμεθαζόνης. Τα ευρήματα έδειξαν οτι τα κύτταρα ανταποκρίθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της ουσίας με αναστολή του κυτταρικού κύκλου, δίνοντας το έναυσμα για περαιτέρω μελέτη του συστήματος των γλυκοκορτικοειδών σε κυτταρικό επίπεδο. Επιπλέον, ενδιαφέρον παρουσίασε η διερεύνηση της αλληλεπίδρασης δύο συστημάτων που σχετίζονται με το στρες, των ενδοκανναβινοειδών και των κορτικοειδών. Τα αποτελέσματα μαρτυρούν οτι η ενδοφλέβια χορήγηση εκθετικά αυξανόμενων δόσεων Δ9-THC ενεργοποιεί τον άξονα ΗΡΑ με αύξηση της έκφρασης των μορίων GR, MR και UBE3A. Συνολικά υποθέτουμε ότι το συνθετικό κανναβινοειδές μπορεί να περιορίζει τα συμπτώματα του στρες, δεδομένου ότι παρατηρούμε αντίθετα αποτελέσματα από εκείνα του μητρικού αποχωρισμού. Εξετάστηκε επίσης ο ρόλος των μιτοχονδρίων στης απόκριση του εγκεφάλου στο άγχος. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα των συμπλόκων της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων και των μορίων SLC25A22, NMDAR, Cyt C, οδηγούν στο συμπέρασμα οτι ο νευρικός φαινότυπος δεν συνδέεται με το μιτοχονδριακό πρωτέωμα. Ωστόσο χαμηλά επίπεδα άγχους φαίνεται να συνδέονται με υψηλή ροή ασβεστίου στα κύτταρα του ραβδωτού σώματος του εγκεφάλου. Τέλος, ένα σημαντικό μέρος της διατριβής εστιάστηκε στη διερεύνηση του πιθανού μηχανισμού ενεργοποίησης της οστεογένεσης κατά την επίδραση μηχανικού στρες σε διαφοροποιούμενα κύτταρα hAT-MSCs. Το πείραμα αυτό αποτέλεσε μια προσπάθεια απόδοσης σε κυτταρικό επίπεδο, του περιβάλλοντος που προκαλεί έκτοπη οστεοποίηση. Παρατηρήσαμε ότι η σταθερή επίδραση μηχανικού στρες στο κυτταρικό μας σύστημα οδήγησε σε πρώιμη οστεογένεση με ταυτόχρονη απομεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου GNAS. Η πλήρης κατανόηση του μοριακού μηχανισμού μπορεί να συντελέσει στην εξέλιξη μεθόδων πρόληψης ή αντιμετώπισης της έκτοπης οστεοποίησης. Κοινός στόχος των επιμέρους ενοτήτων της διατριβής ήταν η κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την ανταπόκριση του οργανισμού στα περιβαλλοντικά ερεθίσματα, με απώτερο σκοπό τη συμβολή στην εξέλιξη νέων θεραπευτικών μεθόδων για διαταραχές που έχουν ως αιτία διάφορες μορφές στρες.