Biotechnological treatment of olive mill wastewaters-based media: production of added-value compounds with the use of strains of yeasts Yarrowia lipolytica and Saccharomyces cerevisiae

Abstract

The ability of two yeast species, Yarrowia lipolytica [strains ACA-YC 5028, ACA-YC 5033and W29 (ATCC 20460)] and Saccharomyces cerevisiae (strain MAK-1), to simultaneouslybioremediate (reduce phenolic content and color) olive mill wastewater (OMW)-based media andproduce (high-) added value products (yeast biomass, citric acid, ethanol, cellular lipids) wasassessed at the present study, which is divided in four main parts: In the first part of this work, theability of three Yarrowia lipolytica strains to grow on and convert glucose-enriched OMWs intomicrobial mass, cellular lipids and citric acid in aseptic shake-flask cultures was assessed.Decolorization (~63%) and removal of phenolic compounds (~34% w/w) occurred. In nitrogenlimitedcultures citric acid in non-negligible quantities was produced [maximum citric acid (Citmax)~18.1 g L−1; total citric acid yield on glucose consumed (YCit/Glc) ~0.51 g g−1] but adaptation ofcultures to media supplemented with OMWs reduced the final citric acid quantity and conversionyield values achieved. In contrast, the accumulation of cellular lipids was favored by OMWsaddition compared to the control experiment (no OMWs addition). On the other hand, in carbonlimitedcultures, insignificant amounts of citric acid were produced (as excpected) whereas, despitethe presence of inhibitory compounds into the medium, biomass production [maximum biomass(Xmax) ~13.0 g L−1; dry cell weight yield on glucose consumed (YX/Glc) ~0.45 g g−1] was enhanced with the addition of OMWs into the synthetic medium, as compared with the control experiment(no OMW addition). Fatty acid analysis of total cellular lipids produced demonstrated that for allstrains, cultures in media supplemented with OMWs favored the biosynthesis of cellular lipids thatcontained increased concentrations of cellular oleic acid.In the second part of this thesis, the ability of a selected Y. lipolytica strain that in theprevious part had produced significant quantities of citric acid irrespective of the addition of OMWsinto the medium, namely ACA-YC 5033, to grow on glucose-enriched OMWs was further studied.Higher quantities of OMWs as compared with the first part of the work were added, trials were alsoperformed in pasteurized media (besides aseptic cultures), while equally batch bioreactorexperiments were performed. Decolorization (~58%) and remarkable removal of phenoliccompounds [up to 51% w/w, at the trial with initial phenolic compounds concentration (Ph0) ~5.50g L-1] occurred. Such high value of phenolic compounds removal from the fermentation mediumthat occurred in the above-mentioned fermentation, was amongst the highest ones reported so far inthe international literature concerning growth of yeasts on phenol-containing residues. In nitrogenlimitedflask fermentations (in which Citmax~19.0 g L−1; YCit/Glc~0.74 g g−1), dry cell weightconcentration was reduced proportionally to the phenolic content but the addition of OMWs, very interestingly, stimulated proportionally reserve lipid accumulation process [maximum total lipid(Lmax) ~1.0 g L−1; total lipid yield in biomass (YL/X) ~0.27 g g−1] comparing to control experiments,suggesting that OMWs seemed to be a “lipogenic” medium. The overall maximum total citric acidconcentration achieved (Citmax~47.0 g L−1; YCit/Glc~0.67 g g−1) occurred in the trial with the highestcommercial sugar supplementation of OMW-based media (initial glucose concentration, Glc0,~80.0 g L−1). On the other hand, cultures performed at high phenol content media (Ph0~4.50 and5.50 g L−1) clearly inhibited the growth of the microorganism, but surprisingly enough lipidaccumulation seemed to be stimulated by the addition of OMWs at these ratios. In carbon-limitedfermentations, biomass production was enhanced by OMW addition. In the aspect of a potentialscale-up of the technology and in order to reduce the cost of the proposed bioprocess, shake-flaskand batch bioreactor experiments were performed in a previously pasteurized medium; comparingaseptic and pasteurized shake-flasks cultures, no significant differences were observed in kinetics(for both biomass and lipid production) while the assimilation rate of glucose (in g L-1 h-1) seemedto be linear for both experiments, with glucose consumption rate being higher in the aseptic than thein pasteurized cultures. On the contrary reduction of citric acid production was observed in thepasteurized trial by both means of Citmax and YCit/Glc values. Comparing aseptic shake-flask and therespective aseptic bioreactor fermentations of OMW-based media (that presented almost equal Glc0and Ph0 concentrations), biomass and lipid production were insignificantly enhanced in bioreactortrials whereas the strain reached its kinetics plateau earlier in shake-flasks than in bioreactorcultures. Glucose consumption rate was higher in the shake-flask cultures. Concerning citric acidproduction, it seemed to decrease in the bioreactor cultures (by both means of Citmax and YCit/Glcvalues).At the third part of the manuscript, the ability of Saccharomyces cerevisiae strain MAK-1 togrow on and convert glucose-enriched OMWs into biomass, cellular lipids and ethanol in asepticand non-aseptic shake-flask and batch bioreactor cultures was assessed. In general, aseptic and nonasepticprocesses demonstrated similar kinetic results. Decolorization (∼63%) and phenol removal(∼34% w/w) from OMWs was achieved. In aseptic shake-flask cultures, enrichment with OMWsincreased ethanol and biomass production. Batch-bioreactor trials performed showed higher ethanol[maximum ethanol concentration (EtOHmax) ~52.0 g L-1; ethanol yield on glucose (YEtOH/Glc) ~0.46g g−1] and lower biomass quantities compared with the respective shake-flask experiments. Moreover, OMWs addition in batch-bioreactor trials significantly enhanced biomass productionwhile it did not remarkably affect ethanol biosynthesis. Fatty acid analysis of cellular lipidsdemonstrated that in OMW-based media, cellular lipids contained increased concentrations of oleic and linoleic acid in accordance with the repective trials of the first part of this study when Y.lipolytica strains were used.At the fourth part of this thesis, the ability of Saccharomyces cerevisiae strain MAK-1 togrow on and convert blends of OMWs and molasses into biomass and ethanol under non-asepticshake-flask and batch bioreactor cultures was assessed. OMWs were used as simultaneous substrateand process water of the fermentations employed and molasses were used as low-cost substrate tosupplement already existing OMWs sugar content for the enhancement of added value compoundsproduction. The rationale of the utilization of OMW and molasses blends was to study the effect ofthese mixtures of residues upon the physiological and kinetic behavior of the strain, since in apotential scale-up of the process, OMWs could be used as tap water substitute for molasses dilution.This is the first time in the international literature in which such types of blends are used in afermentation process. Decolorization (~60%) and removal of phenolic compounds (~28% w/w)occurred. Under aerated conditions in shake-flask cultures, adaptation of cultures to molasses mediasupplemented with OMWs did not significantly decrease ethanol and biomass production. Undersimilar aerated bioreactor cultures biomass production (Xmax~5.7 g L-1; yield of dry cell weight pertotal sugars consumed (YX/TS) ~0.07 g g−1) was reduced whereas ethanol production (EtOHmax~42.0 g L-1; YEtOH/TS~0.49 g g−1) significantly increased as compared with the flask cultures. Comparingaerobic with non-aerated bioreactor experiments, biomass production showed some slight decreasewhereas ethanol production slightly increased in the latter case.The yeast strains tested in this study could be regarded as possible candidates forsimultaneous OMWs remediation and production of (added-) value compounds, in some casesunder completely non-aseptic conditions. μελάσας και ΥΑΕ. Η αρχική συγκέντρωση ολικών σακχάρων ήταν ~100.0 g L-1 και η προσθήκητων ΥΑΕ έγινε στις εξής αναλογίες (% v/v): 0, 10, 20, 30, 40, 50. Η παραγωγή της βιομάζας δενεπηρεάστηκε σοβαρά από την προσθήκη ΥΑΕ στο μέσο, αλλά οι μέγιστες τιμές Xmax και τουσυντελεστή απόδοσης της παραγόμενης βιομάζας προς αναλωθέντα συνολικά σάκχαρα YX/TS παράχθηκαν στην καλλιέργεια χωρίς προσθήκη ΥΑΕ. Η ποσότητα των ολικών σακχάρων πουέμεινε ακατανάλωτη αυξήθηκε με την προσθήκη ΥΑΕ. Αναφορικά με τη βιοσύνθεση τηςαιθανόλης, η προσθήκη ΥΑΕ στο μίγμα επηρέασε αρνητικά την παραγωγή της εν συγκρίσει με τοπείραμα χωρίς την προσθήκη ΥΑΕ (μόνο μελάσα). Η προσθήκη ΥΑΕ σε αναλογία 20% v/v έδωσεικανοποιητικά αποτελέσματα – αναφορικά με τη βιοσύνθεση τόσο βιομάζας όσο και αιθανόλης –οπότε και επιλέχθηκε ως συνθήκη για εφαρμογή σε ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρες υπό μηασηπτικές συνθήκες. Αρχικά μελετήθηκε η επιρρόη του αερισμού (0.0 και 1.2 vvm) τηςκαλλιέργειας. Παρατηρήθηκε μη αξιοσημείωτη ελάττωση στην παραγωγή της βιομάζας αλλά καιαύξηση στη βιοσύνθεση της αιθανόλης στις καλλιέργειες υπό μη αερισμό. Συγκρινόμενες και οιδύο προαναφερθείσες συνθήκες με το αντίστοιχο πείραμα στις ανακινούμενες φιάλες, σημειώνεταιπως η παραγωγή της βιομάζας μειώθηκε εμφανώς και η παραγωγή της αιθανόλης αυξήθηκε στιςζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν στο βιοαντιδραστήρα. Επίσης στις καλλιέργειες πουπραγματοποιήθηκαν στις φιάλες, μετά την κατανάλωση όλης της ποσότητας των ολικών σακχάρωντου μέσου, η αιθανόλη που είχε παραχθεί άρχισε να καταναλώνεται προς νέα παραγωγή βιομάζας.Λαμβάνοντας υπ’ όψιν πως στις καλλιέργειες που πραγματοποιήθηκαν στο βιοαντιδραστήρα υπόαναερόβιες, μη ασηπτικές συνθήκες παράχθηκε ελαφρώς υψηλότερη ποσοτητα αιθανόλης, η σειρά πειραμάτων που ακολούθησε πραγματοποιήθηκε χωρίς αερισμό. Επομένως μελετήθηκαν ζυμώσειςστο βιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικές συνθήκες χωρίς αερισμό με προσθήκη ΥΑΕ σε σταθερήαναλογία (20% v/v) και αυξανόμενη συγκέντρωση ολικών σακχάρων (μέσω της προσθήκηςαυξανόμενης ποσότητας μελάσας) σε (g L-1): ~100.0, ~135.0, ~150.0, ~200.0. Η αύξηση τηςποσότητας της μελάσας επηρέασε αρνητικά την αύξηση του μικροοργανισμού και την αφομοίωσητων σακχάρων με αποτέλεσμα στο πείραμα με TS0~200.0 g L-1 να μην παρατηρηθεί καθόλουαύξηση του μικροοργανισμού. Αναφορικά με τη βιοσύνθεση της αιθανόλης, η προσθήκη μελάσαςστο μέσο ευνόησε την παραγωγή της αναλογικά έως την καλλιέργεια με TS0~135.0 g L-1. Πέραναυτής της συγκέντρωσης η παραγωγή της αιθανόλης επηρεάστηκε αρνητικά (π.χ. καθόλουαιθανόλη δεν παράχθηκε στο πείραμα με TS0~200.0 g L-1). Σημειώθηκε αποχρωματισμός (εύροςμέγιστων τιμών 28-60%) και μείωση των φαινολικών ενώσεων (εύρος μέγιστων τιμών 12-26%w/w). Συγκρίνοντας τις τιμές των ποσοστών αποχρωματισμού και μείωσης φαινολικών ενώσεωνστα πειράματα σε φιάλες υπό μη ασηπτικές συνθήκες με αυτές των αντίστοιχων ζυμώσεων σεβιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικές συνθήκες, συμπεραίνεται ότι ήταν παρόμοιες.Τα στελέχη των ζυμομυκήτων που μελετήθηκαν, μπορούν να θεωρηθούν ως υποψήφιοι μικροοργανισμοί για την ταυτόχρονη απορρύπανση των ΥΑΕ και την παραγωγή προϊόντωνυψηλής προστιθέμενης αξίας χρήσιμων στη βιομηχανία των τροφίμων, σε ορισμένες περιπτώσειςυπό μη ασηπτικές συνθήκες.

Στην παρούσα μελέτη, η οποία αποτελείται από τέσσερα μέρη, διερευνήθηκε η ικανότηταδύο ειδών ζυμομυκήτων, του Yarrowia lipolytica [στελέχη ACA-YC 5028, ACA-YC 5033 καιW29 (ATCC 20460)] και του Saccharomyces cerevisiae (στέλεχος MAK-1) να αυξηθούν σευποστρώματα με βάση τα υγρά απόβλητα ελαιουργίας (ΥΑΕ) ώστε να παραχθούν πολύτιμοιμεταβολίτες (βιομάζα, αιθανόλη, κιτρικό οξύ και κυτταρικά λιπίδια) χρήσιμοι στη ΒιομηχανικήΒιοτεχνολογία και την Τεχνολογία Τροφίμων και ταυτοχρόνως να μειωθεί η ρυπογόνος δύναμη τουαποβλήτου μέσω της μείωσης της συγκέντρωσης των φαινολικών ενώσεων αλλά και του χρώματόςτου.Στο πρώτο μέρος, διερευνήθηκε η ικανότητα τριών στελεχών της ζύμης Y. lipolytica νααυξηθούν σε υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ υπό ασηπτικές συνθήκες σε ανακινούμενες φιάλες,ώστε να παραχθεί βιομάζα, κιτρικό οξύ και κυτταρικά λιπίδια υπό συνθήκες περιοριστικές σεάζωτο [αρχική συγκέντρωσης γλυκόζης (Glc0) ~35.0 g L−1, αρχικός λόγος άνθρακα/αζώτου (C/N)~85] και υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα (Glc0~28.0 g L−1, C/N~13). Έγινε προσθήκηΥΑΕ στο συνθετικό μέσο σε διάφορες αναλογίες ώστε η αρχική συγκέντρωση φαινολικώνενώσεων (Ph0) να είναι (σε g L−1): 0.00 (πείραμα αναφοράς χωρίς προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο), ~1.15 και ~1.55. Σημειώθηκε αποχρωματισμός (εύρος μέγιστων τιμών 45-63%) και μείωσητων φαινολικών ενώσεων (εύρος μέγιστων τιμών 13-34% w/w) στο μέσο τόσο στις ζυμώσεις υπόσυνθήκες περιοριστικές σε άζωτο όσο και στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα.Το ποσοστό μείωσης του χρώματος και μείωσης των φαινολικών ενώσεων του μέσου έδειξε νααυξάνεται με την προσθήκη ΥΑΕ (εξαιρώντας το στέλεχος ACA-YC 5033). Στις καλλιέργειες υπόσυνθήκες περιοριστικές σε άζωτο παράχθηκε σε ικανοποιητικές ποσότητες συνολικό κιτρικό οξύ[π.χ. μέγιστη συγκέντρωση κιτρικού οξέος (Citmax) ~18.1 g L−1, με αντίστοιχο συντελεστήαπόδοσης κιτρικού οξέος προς αναλωθείσα γλυκόζη (YCit/Glc) ~0.51 g g−1.για το στέλεχος Y.lipolytica ACA-YC 5033 σε υποστρώματα εμπλουτισμένα με ΥΑΕ]. Το ισοκιτρικό οξύπαρουσίασε μια ποσότητα της τάξης του 5 – 8% w/w του συνολικού κιτρικού οξέος πουπαράχθηκε, ανεξαρτήτα από το στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε. Η προσθήκη ΥΑΕ οδήγησε σεσοβαρή μείωση της παραγωγής του κιτρικου οξέος (τόσο σε απόλυτες τιμές συγκέντρωσης όσο καισε τιμές του συντελεστή απόδοσης) ειδικά για το στέλεχος W29. Αντίθετα, η παραγωγή τωνκυτταρικών λιπιδιών ευνοήθηκε με την προσθήκηΥΑΕ συγκρίνοντας με το πείραμα αναφοράς(χωρίς προσθήκη ΥΑΕ) κυρίως για το στέλεχος W29 [μέγιστη συγκέντρωση ολικού λίπους (Lmax)~1.9 g L−1, λίπος επί ξηρής μάζας (YL/X) ~0.28 g g−1], υποδεικνύοντας πως η προσθήκη ΥΑΕ ευνόησε τη διαδικασία συσσώρευσης λίπους. Αξίζει να σημειωθεί πως στις περισσότερες ζυμώσειςυπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο, παρουσιάστηκε μερική μείωση της συγκέντρωσης του παραγόμενου λίπους (υπό την έννοια τόσο των τιμών Lmax όσο και των τιμών YL/X) στην αρχή τηςστατικής φάσης αύξησης του μικροοργανισμού, ακριβώς πριν ξεκινήσει σε αυξημένεςσυγκεντρώσεις η έκκριση κιτρικού οξέος στο μέσο. Στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σεάνθρακα δεν παράχθηκε κιτρικό οξύ (όπως άλλωστε αναμενόταν) και παρά την ύπαρξηπαρεμποδιστικών παραγόντων (π.χ. φαινολικών συστατικών), η παραγωγή της βιομάζας [μέγιστησυγκέντρωση βιομάζας (Xmax) ~13.0 g L−1, συντελεστής απόδοσης βιομάζας (YX/Glc) ∼0.45 g g−1]ενισχύθηκε με την προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο. Υπήρξε σημαντικά υψηλότερη παραγωγήβιομάζας στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα από ότι στις ζυμώσεις υπόσυνθήκες περιοριστικές σε άζωτο όπως επίσης και ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης ήτανμεγαλύτερος στις ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα. Αναφορικά με την παραγωγήολικού λίπους, στις περισσότερες ζυμώσεις υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα το λίπος επίξηρής μάζας μετρήθηκε στο εύρος 5-12% w/w επί ξηρής ουσίας, υποδεικνύοντας πως δεν υπήρξεαξιοσημείωτη συσσώρευση κυτταρικων λιπιδίων υπό αυτές τις συνθήκες. Η ανάλυση των λιπαρώνοξέων των κυτταρικών λιπιδίων που παράχθηκαν, έδειξε ότι η προσαρμογή όλων των στελεχών τηςζύμης στα υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ έστρεψε το μεταβολισμό προς τη σύνθεση κυτταρικώνλιπιδίων που περιείχαν αυξημένες συγκεντρώσεις κυτταρικού ελαϊκού οξέος.Δεδομένης της δυναμικής του στελέχους ACA-YC 5033 να παράγει σε υψηλές ποσότητεςκιτρικό οξύ ανεξάρτητα από την προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο, στο δεύτερο μέρος τηςδιατριβής, μελετήθηκε η ικανότητα του στελέχους αυτού να αυξηθεί σε υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ (επιπλέον σε ανακινούμενες φιάλες υπό συνθήκες παστερίωσης και σε βιοαντιδραστήρα υπόσυνθήκες ασηπτικές αλλά και υπό συνθήκες παστερίωσης) σε υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις ΥΑΕ(και συνεπώς φαινολικών συστατικών) στο μέσο της καλλιέργειας. Σημειώθηκε αποχρωματισμός(~58%) και αξιοσημείωτη μείωση των φαινολικών ενώσεων [~51% w/w, τιμή που σημειώθηκεανέλπιστα στο πείραμα με αρχική συγκέντρωση φαινολικών ενώσεων (Ph0) ~5.50 g L−1]. Η τόσουψηλή τιμή μείωσης των φαινολικών ενώσεων του μέσου ζύμωσης που σημειώθηκε, ανήκει στιςυψηλότερες τιμές που έχουν αναφερθεί ως τώρα στη διεθνή βιβλιογραφία αναφορικά με τηναύξηση ζυμών σε υπολείμματα που περιέχουν φαινολικές ενώσεις.Στις καλλιέργειες υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο (στις οποίες Citmax~19.0 g L−1,YCit/Glc~0.74 g g−1), η συγκέντρωση της Xmax μειώθηκε αναλογικά με την περιεκτικότητα σεφαινόλες, με την προσθήκη ΥΑΕ στο μέσο. Αξιοσημείωτο είναι πως η προσθήκη ΥΑΕενεργοποίησε τη διαδικασία συσσώρευσης λιπιδίων (Lmax~1.0 g L−1, YL/X~0.27 g g−1) εν συγκρίσειμε το πείραμα αναφοράς, υποδεικνύοντας πως τα ΥΑΕ δείχνουν να αποτελούν ένα«ελαιοσυσσωρευτικό» υπόστρωμα. Η υψηλότερη συγκέντρωση κιτρικού οξέος που σημειώθηκε σεόλη τη μελέτη (Citmax~47.0 g L−1, YCit/Glc~0.67 g g−1), προέκυψε στη ζύμωση με την υψηλότερη προσθήκη εμπορικής γλυκόζης (Glc0~80.0 g L−1). Στα πειράματα με την υψηλότερη συγκέντρωσηφαινολικών ενώσεων (Ph0~4.50 and ~5.50 g L−1) παρουσιάστηκε σημαντική αναστολή τηςαύξησης του μικροοργανισμού αλλά η παραγωγή των κυτταρικών λιπιδίων ενεργοποιήθηκε με τηνπροσθήκη ΥΑΕ σε αυτές τις αναλογίες. Σε συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα, η παραγωγήβιομάζας ενισχύθηκε από την προσθήκη ΥΑΕ. Συγκρίνοντας τις καλλιέργειες σε ανακινούμενεςφιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες και συνθήκες παστερίωσης σημειώθηκαν μη αξιοσημείωτεςαλλαγές όσον αφορά στην κινητική του μικροοργανισμού (τόσο στην παραγωγή βιομάζας οσο καιστην παραγωγή ολικού λίπους) ενώ ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης ήταν γραμμικός και στιςδύο περιπτώσεις με υψηλότερο αυτόν στις ζυμώσεις υπό ασηπτικές συνθήκες από ότι στις ζυμώσειςυπό συνθήκες παστερίωσης. Αντίθετα, παρατηρήθηκε μείωση της παραγωγής κιτρικού οξέος στιςζυμώσεις υπό συνθήκες παστερίωσης υπό την έννοια τόσο των απόλυτων τιμών Citmax όσο και τωνσχετικών τιμών YCit/Glc. Συγκρίνοντας τα πειράματα σε ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικέςσυνθήκες με τα αντίστοιχα πειράματα σε βιοαντιδραστήρα (που παρουσίασαν παρόμοιεςσυγκεντρώσεις Glc0 και Ph0), παρατηρήθηκε μη-αξιοσημείωτη βελτίωση στην παραγωγή βιομάζαςκαι λιπιδιών ενώ το στέλεχος παρουσίασε νωρίτερα τη στατική του φάση στις φιάλες από ότι στοβιοαντιδραστήρα. Ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης ήταν υψηλότερος στις ζυμώσεις σε φιάλες.Η παραγωγή κιτρικού οξέος μειώθηκε στις ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα (υπό την έννοια τόσο τωντιμών Citmax όσο και των τιμών YCit/Glc).Στο τρίτο μέρος, διερευνήθηκε η ικανότητα της ζύμης S. cerevisiae στέλεχος MAK-1 νααυξηθεί σε υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ ώστε να παραχθεί βιομάζα, αιθανόλη και κυτταρικάλιπίδια σε ανακινούμενες φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα υπό ασηπτικές αλλά και μη ασηπτικέςσυνθήκες (σε όλες τις περιπτώσεις η σύγκριση ασηπτικών και μη ασηπτικών συνθηκώνπαρουσίασε παρόμοια κινητική). Στις ζυμώσεις σε ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές αλλά και μη ασηπτικές συνθήκες, έγινε προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο σε διάφορες αναλογίες ώστε ηPh0 να είναι (σε g L−1): 0.00 (πείραμα αναφοράς χωρίς προσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο),~1.20, ~2.00 και~2.90. Για κάθε Ph0 προστέθηκε στο μέσο ποσότητα γλυκόζης ώστε η αρχικήσυγκέντρωσή αυτής να είναι (σε g L−1): ~40.0, ~55.0 και ~75.0 . Τόσο η μέγιστη συγκέντρωσηαρχικής γλυκόζης που επιλέχθηκε, όσο και οι αρχικές συγκεντρώσεις φαινολικών ενώσεων,αναφέρονται στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις που μπορεί να βρεθούν σε τυπικά ΥΑΕ παραγόμενααπό διάφορες μεθόδους πίεσης του ελαιοκάρπου. Στις καλλιέργειες με ανακινούμενες φιάλες υπόασηπτικές συνθήκες, η προσθήκη ΥΑΕ αύξησε θεαματικά την παραγωγή βιομάζας παρά τογεγονός ότι, όπως αναφέρθηκε, τα ΥΑΕ περιέχουν ανασταλτικούς παράγοντες. Η υψηλότερη τιμήΧmax που σημειώθηκε ήταν ~19.0 g L−1 στο πείραμα με Glc0~75.0 g L−1 και Ph0~2.90 g L−1 (ενώΧmax~11.0 g L−1 σημειώθηκε στο αντίστοιχο πείραμα αναφοράς). Επίσης, όπως αναμενόταν, με την αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης γλυκόζης στο μέσο, παρατηρήθηκε και αύξηση της παραγωγήςτης βιομάζας. Σημαντικό σημείο αποτελεί το γεγονός ότι μετά την ολική κατανάλωση της γλυκόζηςτου μέσου, η αιθανόλη που είχε παραχθεί άρχισε να καταναλώνεται προς νέα παραγωγή βιομάζαςκαι σε αρκετές περιπτώσεις δε, παρατηρούταν η ανακατανάλωση όλης της ποσότητας τηςπροηγούμενης συντιθέμενης αιθανόλης. Η μέγιστη συγκέντρωση αιθανόλης (EtOHmax) πουπαράχθηκε στις ζυμώσεις σε ανακινούμενες φιάλες ήταν ~26.0 g L−1 με συντελεστή απόδοσηςαιθανόλης (YEtOH/Glc) ~0.36 g g−1 στο πείραμα με Glc0~75.0 g L−1 και Ph0~2.90 g L−1 ενώ ουψηλότερος συντελεστής απόδοσης αιθανόλης ήταν ~0.47 g g−1 (με αντίστοιχη μέγιστησυγκέντρωση αιθανόλης ~17.0 g L−1) στο πείραμα με Glc0~40.0 g L−1 και Ph0~2.00 g L−1. Ηπροσθήκη ΥΑΕ στο συνθετικό μέσο έως μία συγκεκριμένη αναλογία ευνόησε την παραγωγή τηςαιθανόλης. Λαμβάνοντας υπ’όψιν το συντελεστή απόδοσης αιθανόλης, σημειώνεται πωςσημαντικά υψηλότερη τιμή αυτού παρατηρήθηκε στη ζύμωση με Ph0~2.0 g L−1, συνθήκες οι οποίεςεπιλέχθηκαν για προσαρμογή της πειραματικής διαδικασίας σε ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα.Συγκρίνοντας τις ζυμώσεις σε φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες (Glc0~40.0 g L−1, Ph0~0.00 g L−1 καιGlc0~75.0 g L−1, Ph0~2.90 g L−1) με τις αντίστοιχες υπό μη ασηπτικές συνθήκες, σημειώνεται πως δεν παρατηρήθηκε διαφορά τόσο στην παραγωγή βιομάζας όσο και στην παραγωγή αιθανόλης.Αναφορικά με τις ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα έγινε σύγκρισηπειράματος αναφοράς (ζύμωση χωρίς προσθήκη ΥΑΕ) υπό ασηπτικές και υπό μη ασηπτικέςσυνθήκες χωρίς να παρατηρηθεί αξιοσημείωτη διαφορά στην κινητική του μικροοργανισμού.Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση του αερισμού (0.0, 0.5, 1.0 και 1.5 vvm) της καλλιέργειας καιδεν παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη διαφορά στην κινητική. Λόγω των παραπάνω παρατηρήσεωνεπιλέχθηκαν (για λόγους μείωσης κόστους) οι μη-ασηπτικές συνθήκες χωρίς αερισμό για τησυνέχεια των πειραμάτων με την προσθήκη στο μέσο ΥΑΕ, γεγονός το οποίο οδήγησε σεαξιοσημείωτη αύξηση της βιομάζας χωρίς όμως να επηρεάσει τη βιοσύνθεση της αιθανόλης.Σημειώνεται επίσης πως, οι ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα παρουσίασανυψηλότερες ποσότητες αιθανόλης και χαμηλότερες βιομάζας εν συγκρίσει με τα αντίστοιχαπειράματα των ανακινούμενων φιαλών. Τέλος, προκειμένου να αυξηθεί η συγκέντρωση τηςπαραγόμενης αιθανόλης πραγματοποιήθηκε ζύμωση σε βιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικέςσυνθήκες χωρίς αερισμό με αρχική συγκέντρωση γλυκόζης ~115.0 g L-1 και αρχική συγκέντρωσηφαινολικών ενώσεων ~2.90 g L-1 με EtOHmax~52.0 g L-1 (YEtOH/Glc~0.46 g g−1). Σημειώθηκε αξιοσημείωτος αποχρωματισμός (~63%) και μείωση των φαινολικών ενώσεων (~34% w/w) στομέσο. Για μια δεδομένη αρχική συγκέντρωση γλυκόζης, αναφορικά με τις ζυμώσεις σεανακινούμενες φιάλες, το ποσοστό μείωσης του χρώματος και μείωσης των φαινολικών ενώσεωντου μέσου αυξήθηκε με την προσθήκη ΥΑΕ. Συγκρίνοντας τις τιμές αποχρωματισμού και μείωσης φαινολικών ενώσεων στα πειράματα σε φιάλες υπό μη ασηπτικές συνθήκες με αυτές τωναντίστοιχων ζυμώσεων σε βιοαντιδραστήρα υπό μη ασηπτικές συνθήκες, συμπεραίνεται ότι ήτανπαρόμοιες. Η ανάλυση των λιπαρών οξέων των κυτταρικών λιπιδίων (παράχθηκαν σε ποσότηταμικρότερη του 10% w/w επί ξηρής ουσίας), έδειξε ότι στα υποστρώματα με βάση τα ΥΑΕ τακυτταρικά λιπίδια περιείχαν αυξημένες συγκεντρώσεις ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος, κάτι πουβρίσκεται σε συμφωνία με τα αντίστοιχα πειράματα του πρώτου μέρους αυτής της μελέτης όπουμελετήθηκαν τα κυτταρικά λιπίδια του μικροοργανισμού Y. lipolytica.Στο τέταρτο μέρος, ερευνήθηκε η ικανότητα της ζύμης S. cerevisiae στέλεχος MAK-1 νααυξηθεί σε μίγματα ΥΑΕ και μελάσας, ώστε να παραχθεί βιομάζα και αιθανόλη σε ανακινούμενεςφιάλες και βιοαντιδραστήρα υπό αερόβιες και αναερόβιες, μη ασηπτικές συνθήκες. Τα ΥΑΕχρησιμοποιήθηκαν ταυτοχρόνως τόσο ως υπόστρωμα της ζύμωσης όσο και ως νερό της διεργασίαςκαι η μελάσα ως χαμηλού κόστους υπόστρωμα για τον εμπλουτισμό των ήδη υπαρχόντωνσακχάρων των ΥΑΕ προς την ενίσχυση της παραγωγής προϊόντων προστιθέμενης αξίας. Η λογικήτης χρήσης μιγμάτων ΥΑΕ και μελάσας ήταν η μελέτη της επίδρασης των μιγμάτων αυτών στηφυσιολογία και την συμπεριφορά της κινητικής του στελέχους, καθώς σε ενδεχόμενη κλιμάκωσημεγέθους των ζυμώσεων, τα ΥΑΕ θα μπορούσαν να αντικαταστήσουν το νερό που χρησιμοποιείται για την αραίωση της μελάσας στη διαδικασία βιοτεχνολογικής επεξεργασίας και αξιοποίησής της.Πραγματοποιήθηκαν προκαταρτικά πειράματα σε υποστρώματα μελάσας αραιωμένα με νερό[αρχική συγκέντρωση ολικών σακχάρων (TS0) ~100.0 g L-1, χωρίς την προσθήκη ΥΑΕ] υπόαερόβιες ασηπτικές συνθήκες σε ανακινούμενες φιάλες για να αξιολογηθεί η προσθήκη διαλύματοςμεταλλικών αλάτων (η σύσταση της μελάσας περιλαμβάνει μη αμελητέα ποσότητα μεταλλικώνστοιχείων). Η προσθήκη μεταλλικών αλάτων στο μέσο επηρέασε αρνητικά την παραγωγή τηςβιομάζας και της αιθανόλης, επομένως η πρακτική αυτή εξαιρέθηκε από τη συνέχεια τωνπειραμάτων. Κατόπιν, ζυμώσεις με μίγματα μελάσας και ΥΑΕ (προσθήκη 10% v/v) σεανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες συγκρίθηκαν με αντίστοιχες καλλιέργειες υπό μηασηπτικές συνθήκες. Η συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης ήταν ελαφρώς υψηλότερη και ησυγκέντρωση της βιομάζας χαμηλότερη στις ζυμώσεις υπό ασηπτικές συνθήκες. Ταπροαναφερθέντα πειράματα υπό μη ασηπτικές συνθήκες θεωρήθηκαν ικανοποιητικά γεγονός τοοποίο οδήγησε στην εφαρμογή μη ασηπτικών συνθηκών στις υπόλοιπες ζυμώσεις. Στη συνέχειαεκτελέστηκαν πειράματα σε ανακινούμενες φιάλες υπό μη ασηπτικές συνθήκες με μίγματα