Ανάπτυξη ενζυμικών διεργασιών για την επεξεργασία ενώσεων φυσικής προέλευσης

Abstract

The present thesis deals with the enzymatic modification of selective antioxidant compounds of plant origin (silybin and rutin) with simple fatty acids, esters of fatty acids and dicarboxylic acids by lipase CALB (Novozym®435) in organic solvents, in order to increase their lipophilic nature and modify their biological action. Several parameters were studied concerning their impact on the performance of the enzymatic process. Acetone was the most suitable medium for the studied enzymatic processes, since its use lead to the highest conversion of silybin. Using simple fatty acids for the enzymatic acylation of silybin, it was found that the conversion increased by increasing the fatty chain length from 8 to 16 carbon atoms. Increasing the number of carbon atoms from 16 to 18, resulted in lower performance. The highest conversion was determined when butyric acid was used as acyl donor, a short chain fatty acid with 4 carbon atoms, in the presence of lipase Novozym®435 in acetone after 96 h at 50°C. In all cases, higher conversion yields were determined when fatty acids esters were used as acyl donors, instead of their corresponding fatty acids. Regardless of the acyl donor nature, increase of its concentration led to higher silybin conversion as well as higher reaction initial velocity, due to thermodynamic equilibrium shift towards synthesis. Using acetone as reaction medium, increase of silybin concentration led to higher process productivity. Of the organic solvents studied, acetone and acetonitrile were those that led to high conversion yields for the synthesis of mono-and di- acylated silybin derivatives, irrespectively of the dicarboxylic acid used. Lipase Novozym®435 exhibited higher selectivity for dicarboxylic acids with long carbon chain length (16 carbon atoms). In all cases, increasing of dicarboxylic acid concentration resulted in increased silybin conversion until the amount of the acyl donor exceeded the maximum solubility capacity of the solvent. Increasing silybin concentration led to increased monoester synthesis and reduced formation of corresponding diester. When rutin was used, only mono acylated derivatives were detected, unlike silybin for which both mono-and di-esters were detected. The aim of this study was also to introduce a lipase or esterase capable of catalyzing adequately the acylation of flavonoids (rutin and narigin) and anthocyanins (cyanin), and to investigate the feasibility of improving the catalytic performance by using "directed evolution" methodology. The reaction between nargin and vinyl butyrate in tertiary alcohol was chosen as model reaction. The reaction leads to the formation of narigin butyrate accompanied by vinyl alcohol release, which is automatically tautomerized into acetaldehyde. Acetaldehyde reacts with NBD-H, which is added to the system, and the complex formed can be fast and with sufficient sensitivity determined photometrically. Finally, the effect of the new compounds on cell proliferation, secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) and induction of apoptosis in human leukemia K562 cells was investigated. Additionally, their ability to induce the proteasome activity, a protein complex with important role in maintaining cellular homeostasis and cellular aging, was estimated in order to assess their anti-aging action. It was found that the antiproliferative effect of the new silybin esters with simple fatty acids on human leukemia K562 cells, was significantly retained compared to the parental compound (silybin). Silybin esters with dicarboxylic acids maintained the antiproliferative and anti-angiogenic effect of the parental compound and in some cases the effect was strengthened (ester of silybin with hexadecanedioic acid). The esters of silybin with dicarboxylic acids, did not induce the apoptosis of human leukemia K562 cells in contrast to silybin. In this study, the effect of silybin and its esters with simple fatty and dicarboxylic acids on the proteolytic activity of the proteasome was evaluated, in order to determine whether these substances inhibit the aging phenomenon in vitro. The ester with hexadecanedioic acid led to proteasome induction for all the studied concentrations and the determined proteasome proteolytic activity was higher than the parental compound.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η καταλυόμενη από λιπάση CALB (Novozym®435) εκλεκτική ακυλίωση αντιοξειδωτικών ενώσεων φυτικής προέλευσης (σιλυμπίνη και ρουτίνη) με απλά λιπαρά οξέα, εστέρες λιπαρών οξέων και δικαρβοξυλικά οξέα σε οργανικούς διαλύτες, με στόχο την αύξηση του λιπόφιλου χαρακτήρα τους και την τροποποίηση της βιολογικής τους δράσης. Η ακετόνη επιλέχθηκε ως ο καταλληλότερος διαλύτης ως μέσο για τις ενζυμικές διεργασίες υπό μελέτη, αφού οδήγησε στις υψηλότερες αποδόσεις μετατροπής των φυσικών αντιοξειδωτικών. Αναφορικά με τη χρήση απλών λιπαρών οξέων για την ενζυμική ακυλίωση της σιλυμπίνης, διαπιστώθηκε ότι η ποσοστιαία απόδοση μετατροπής αυξήθηκε με αύξηση του μήκους της ανθρακικής αλυσίδας από 8 σε 16 άτομα άνθρακα, ενώ αύξηση του αριθμού των ατόμων άνθρακα από 16 σε 18, οδήγησε σε μείωση της απόδοσης. Η υψηλότερη απόδοση μετατροπής προσδιορίστηκε όταν χρησιμοποιήθηκε ως ακυλοδότης βουτυρικό οξύ. Σε όλες τις περιπτώσεις ενζυμικής ακυλίωσης της σιλυμπίνης, υψηλότερες αποδόσεις προσδιορίστηκαν όταν ως ακυλοδότες χρησιμοποιήθηκαν εστέρες λιπαρών οξέων αντί για τα αντίστοιχα απλά λιπαρά οξέα. Ανεξάρτητα από τον τύπο του ακυλοδότη, η αύξηση της συγκέντρωσής του οδήγησε σε αύξηση της απόδοσης μετατροπής καθώς επίσης και σε αύξηση της αρχικής ταχύτητας των αντιδράσεων. Από τους οργανικούς διαλύτες που μελετήθηκαν, η ακετόνη και το ακετονιτρίλιο ήταν εκείνοι που οδήγησαν στην υψηλότερη απόδοση μετατροπής για τη σύνθεση μόνο- και δι-ακυλιωμένων παραγώγων σιλυμπίνης με όλα τα δικαρβοξυλικά οξέα. Διαπιστώθηκε εκλεκτικότητα της λιπάσης Novozym®435 για μεγάλης ανθρακικής αλυσίδας δικαρβοξυλικά οξέα (16 άτομα άνθρακα). Σε όλες τις περιπτώσεις, η αύξηση της συγκέντρωσης του δικαρβοξυλικού οξέος οδήγησε σε αύξηση της απόδοσης της αντίδρασης ακυλίωσης της σιλυμπίνης. Η χρήση ρουτίνης δεν οδήγησε σε σύνθεση διεστέρων και σε όλες τις περιπτώσεις η απόδοση μετατροπής ήταν χαμηλότερη συγκριτικά με τη σιλυμπίνη. Στόχο της συγκεκριμένης μελέτης αποτέλεσε επίσης, η εύρεση λιπάσης ή εστεράσης ικανής να καταλύει με επάρκεια την ακυλίωση φλαβονοειδών (ρουτίνη και ναριγκίνη) και ανθοκυανινών (κυανίνη), και η διερεύνηση της δυνατότητας βελτίωσης της καταλυτικής συμπεριφοράς με την αξιοποίηση των μεθόδων «κατευθυνόμενης εξέλιξης». Η αντίδραση μεταξύ ναριγκίνης και βινυλεστέρα του βουτυρικού οξέος σε τριτοταγή αλκοόλη ήταν εκείνη που επιλέχθηκε για μελέτη. Η συνθετική δάση του ενζύμου υπό τις συγκεκριμένες συνθήκες, οδηγεί σε σχηματισμό εστέρα ναριγκίνης με βουτυρικό οξύ και απελευθέρωση βινυλικής αλκοόλης η οποία αυτόματα μετασχηματίζεται σε ακεταλδεΰδη. Στη συνέχεια η ακεταλδεΰδη σχηματίζει σύμπλοκο με την ένωση NBD-H που έχει προστεθεί στο σύστημα και το οποίο μπορεί να προσδιοριστεί φωτομετρικά. Δεν εντοπίστηκε κλώνος ικανός να καταλύει την αντίδραση σύνθεσης υπό μελέτη. Τέλος, ελέγχθηκε η δράση των νέων ενώσεων στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την έκκριση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και την επαγωγή της απόπτωσης στην καρκινική σειρά ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων Κ562. Επίσης, μελετήθηκε η ικανότητά τους να ενεργοποιούν το πρωτεάσωμα. Διαπιστώθηκε ότι η παρεμποδιστική δράση των νέων εστέρων σιλυμπίνης με απλά λιπαρά οξέα στον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων Κ562, διατηρήθηκε σε σημαντικό βαθμό συγκρινόμενη με τη μητρική ένωση (σιλυμπίνη). Οι εστέρες σιλυμπίνης με δικαρβοξυλικά οξέα διατήρησαν την παρεμποδιστική δράση της μητρικής ένωσης στον πολλαπλασιασμό καθώς και την έκκριση του αγγειακού ενδοθηλιακού παράγοντα ανάπτυξης (VEGF) από ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα Κ562 και σε ορισμένες περιπτώσεις η δράση ενισχύθηκε. Τέλος, τα νέα ανάλογα της σιλυμπίνης μετά από ενζυμική ακυλίωση με δικαρβοξυλικά οξέα, βρέθηκε ότι σε αντίθεση με τη σιλυμπίνη δεν προκαλούν επαγωγή της απόπτωση σε ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα Κ562. Ο εστέρας της σιλυμπίνης με δεκαεξανοδιοϊκό οξύ ήταν εκείνος που οδήγησε σε επαγωγή της δράσης του πρωτεασώματος αφού για όλες τις υπό μελέτη συγκεντρώσεις προσδιορίστηκε πρωτεολυτική δράση πρωτεασώματος υψηλότερη από εκείνη της μητρική ένωσης.