Μελέτη οικογενειών με κληρονομικές αμφιβληστροειδοπάθειες με σύγχρονες μοριακές τεχνικές

Abstract

In this study we focused on the elucidation of the genetic causes related to the specific types of retinal dystrophies. Accurate and robust protocols have been developed for the investigation of the possible role of three genes (RPE65, ABCA4 and RHO) on the pathogenesis of hereditary retinal dystrophies in the Greek population. Mutations in these genes have been associated with several forms of retinal dystrophies and retinal dysfunctions. To our knowledge there is no previous study for the Greek population on the correlation between genetic aberrations in the aforementioned genes and the clinical phenotype of the patients. This study included Greek families with hereditary retinal dystrophies. The methodology that was used in order to identify possible causative mutations and copy number variations was full gene sequencing and array-comparative genomic hybridization. In particular, the RPE65 gene was sequenced in families with Leber congenital amaurosis and autosomal recessive retinitis pigmentosa. The ABCA4 gene was also sequenced in families with Stargardt’s disease, autosomal recessive retinitis pigmentosa and autosomal recessive cone-rod dystrophy. The RHO gene was screened for mutations in families with autosomal recessive retinitis pigmentosa. Evaluation of all variants was attempted with the use of bioinformatic tools. Allele and genotype frequencies were compared to the control general population. DNA sequencing results include known mutations and two novel genetic variants both in coding and non coding regions. Array-CGH analysis revealed two partial deletions of USH2A and MYO3A in two patients with nonsyndromic autosomal recessive retinitis pigmentosa. The mutation spectrum in Greek patients with retinal dystrophies differs from other populations. Bioinformatic tools, segregation analysis along with clinical data from the patients seemed to be crucial for the evaluation of genetic variants and particularly for the discrimination between causative and non-causative variants.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρήθηκε η διερεύνηση των γενετικών αιτιών που σχετίζονται με συγκεκριμένες κληρονομικές αμφιβληστροειδοπάθειες. Συγκεκριμένα αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα μοριακών τεχνικών για τη μελέτη του πιθανού ρόλου τριών γονιδίων (RPE65, ABCA4 και RHO) στην παθογένεση των νοσημάτων αυτών στον ελληνικό πληθυσμό. Μεταλλάξεις σε αυτά τα γονίδια έχουν σχετιστεί με διάφορες μορφές κληρονομικών αμφιβληστροειδοπαθειών και δυσλειτουργιών. Η μελέτη του εντοπισμού και της συσχέτισης πιθανών μεταλλάξεων στα γονίδια αυτά στον ελληνικό πληθυσμό πραγματοποιείται από όσο γνωρίζουμε για πρώτη φορά. Το υλικό μελέτης αποτέλεσαν ελληνικές οικογένειες με κληρονομικές παθήσεις του αμφιβληστροειδούς. Η μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε στον εντοπισμό πιθανών μεταλλάξεων βασίστηκε στην ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του DNA και στη μέθοδο μικροσυστοιχιών συγκριτικού γενωμικού υβριδισμού. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε το γονίδιο RPE65 σε οικογένειες με συγγενή αμαύρωση Leber και αυτοσωματική υπολειπόμενη μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια. Επιπρόσθετα, αναλύθηκε η αλληλουχία του γονιδίου ABCA4 σε οικογένειες με νόσο Stargardt, αυτοσωματική υπολειπόμενη μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια και αυτοσωματική υπολειπόμενη δυστροφία κωνίων-ραβδίων. Τέλος μελετήθηκε το γονίδιο RHO σε οικογένειες με αυτοσωματική υπολειπόμενη μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια. Όλες οι γενετικές αλλαγές αξιολογήθηκαν με in silico προγράμματα. Η συχνότητες των γενετικών αλλαγών που εντοπίστηκαν για πρώτη φορά συγκρίθηκαν με δείγματα ελέγχου από το γενικό πληθυσμό. Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης του DNA περιλαμβάνουν γνωστές και μη καταγεγραμμένες παθολογικές μεταλλάξεις σε κωδικοποιούσες και μη περιοχές. Με τη μέθοδο μικροσυστοιχιών συγκριτικού γενωμικού υβριδισμού εντοπίστηκαν δύο ελλείμματα στα γονίδια USH2A και MYO3A σε δύο ασθενείς με αυτοσωματική υπολειπόμενη μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια. Το φάσμα των μεταλλάξεων των Ελλήνων ασθενών διαφέρει σε σχέση με άλλους πληθυσμούς. Η επέκταση του μοριακού ελέγχου στους υγιείς συγγενείς αλλά και σε δείγματα ελέγχου από το γενικό πληθυσμό και η χρήση προγραμμάτων βιοπληροφορικής είναι σημαντική για την αξιολόγηση των γενετικών αλλαγών και για τον διαχωρισμό τους σε παθολογικές ή μη.