Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ορμονών με αυξητική δράση σε βιολογικά δείγματα με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών

Abstract

The issue of using anabolic steroids as growth promoters in the livestock farming started to engage the scientific community and the public opinion since thirty years now. Since then there were various approaches, but the issue continues speculating not only the scientists but also the citizens as consumers. A wide range of different anabolic steroids have been used in the livestock farming for increasing the muscular mass of the animals, leading to various products of animal origin. Αs a result the health of consumers is placed in danger. Because of the above, the use of steroids and other growth promoters was prohibited in the E.U. from 1986. According to Commission Directive 98/179/EC, all member-states of E.E. must develop National Reference Laboratories that would have in their competence to develop a program for the control of residues, in which a wide range of anabolic steroids will be analyzed. Therefore, it is imperative to have analytical methods with adequate selectivity for the unambiguous detection and confirmation of these substances. Α multi residue method based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionization (LC-APCI-MS/MS) has been developed for the determination of 20 anabolic steroids (diethylstilbestrol, β-estradiol, ethynylestradiol, α/β-boldenone, α/β-nortestosterone, methyltestosterone, β-trenbolone, triamcinolone acetonide, dexamethasone, flumethasone, α/β-zearalenol, α/β-zaeralanol, zearalenone, melengestrol acetate, megestrol acetate and medroxyprogesterone acetate) from a wide range of chemical groups/families (Stilbenes, Steroids, Corticosteroids, Resorcyclic acid lactones, Gestagens etc) in muscle tissue The procedure involved hydrolysis, extraction with ΤΒΜΕ, defattening and final clean up with solid phase extraction (SPE) on Oasis HLB and Amino cartridges. The analytes were analyzed, in positive and negative multiple reaction monitoring (MRM) mode, acquiring two diagnostic product ions from each of the chosen precursor ions for the unambiguous confirmation of the hormones. The method was validated according to the Commission Decision 2002/657/EC, at the validation level of 0.5 ng/g. The accuracy and precision of the method were satisfactory. The decision limits (CCα) ranged from 0.03 to 0.14 ng/g while the detection capabilities (CCβ) ranged from 0.05 to 0.24 ng/g. The recoveries were satisfactory and ranged from 78.7% to 119.4% with the CVs (%) ranging from 1.9% to 14.1%. The method proved to be sensitive and reliable and hence it is useful for residue control programs. A method based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionization (LC-APCI-MS/MS) has been developed for the determination of gestagens (medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate and melengestrol acetate) in kidney fat. The procedure involved a clean up procedure with gel permeation chromatography (GPC). The analytes were analyzed in positive multiple reaction monitoring (MRM) mode, acquiring two diagnostic product ions from the chosen precursor for the unambiguous confirmation of the gestagens. The method was validated according to the Commission Decision 2002/657/EC at the validation level of 1.0 ng/g. The accuracy and precision of the method were satisfactory. The CCα ranged from 0.20 to 0.22 ng/g while the CCβ ranged from 0.33 to 0.38 ng/g. The recoveries were satisfactory and ranged from 72.0% και 89.2% with the CVs (%) ranging from 2.5% to 16.2%. The method proved to be specific, simple, sensitive and automated and thus renders an appropriate mean for laboratories that focus on official residue controls. The laboratory participated at the proficiency test “Gestagens in porcine kidney fat”, organized by the Community Reference Laboratory (CRL) in hormones (RIVM, Bilthoven, The Netherlands) among the NRLs (National Reference Laboratories, Veterinary Laboratory of Serres is the Greek NRL for hormones in foods of animal origin). The aim of this study was to assess the ability to identify and to quantify residues of medroxyprogestarone-acetate in kidney fat. The results provided to be satisfactory at low (1.03 ng/g, z-score=0.11, CV=2%) and high concentrations for MPA (4.95 ng/g, z-score=0.91, CV = 2%). The total score from the evaluation performance of all labs ranged from 6 to 9, with the Veterinary Laboratory of Serres getting a score of 9. A liquid chromatography-tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) multi residue method has been developed for the determination of 15 anabolic steroids (diethylstilbestrol, dienestrol, hexestrol, β-estradiol, ethynylestradiol, α/β-boldenone, α-nortestosterone, α/β-zearalenol, α/β-zaeralanol, zearalenone, stanozolol and 16β-OH-stanozolol) in bovine urine...

Το ζήτημα της χρήσης των στεροειδών αναβολικών ως αυξητικών παραγόντων στην κτηνοτροφία άρχισε να απασχολεί την επιστημονική κοινότητα και την κοινή γνώμη πριν από 30 περίπου χρόνια. Έκτοτε και μέχρι σήμερα υπήρξαν διάφορες προσεγγίσεις, αλλά το θέμα εξακολουθεί να απασχολεί σοβαρά μέχρι σήμερα τόσο τους επιστήμονες όσο και τους πολίτες ως καταναλωτές. Ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών στεροειδών αναβολικών έχει χρησιμοποιηθεί στην κτηνοτροφία ως μέσο αύξησης της μυϊκής μάζας των ζωών, τα οποία καταλήγουν σε διάφορα προϊόντα ζωικής προέλευσης, με αποτέλεσμα να τίθεται σε κίνδυνο η δημόσια υγεία. Λόγω των παραπάνω, η χρήση των στεροειδών και άλλων αυξητικών παραγόντων απαγορεύτηκε στην Ε.Ε. από το 1986. Σύμφωνα με την Κοινοτική Οδηγία 98/179/EC, όλα τα κράτη-μέλη της Ε.Ε. θα πρέπει να αναπτύξουν Εθνικά Εργαστήρια Αναφοράς που να έχουν στην αρμοδιότητά τους την ανάπτυξη ενός Προγράμματος Ελέγχου Καταλοίπων, στο οποίο να αναλύεται ένα ευρύ φάσμα στεροειδών αναβολικών. Το γεγονός αυτό καθιστά αναγκαία την ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων, με την απαιτούμενη ευαισθησία για την αναμφισβήτητη ανίχνευση και επιβεβαίωση των ουσιών αυτών. Στην ερευνητική αυτή εργασία αναπτύχθηκε μέθοδος ταυτόχρονου προσδιορισμού 20 ορμονών (diethylstilbestrol, β-estradiol, ethynylestradiol, α/β-boldenone, α/β-nortestosterone, methyltestosterone, β-trenbolone, triamcinolone acetonide, dexamethasone, flumethasone, α/β-zearalenol, α/β-zaeralanol, zearalenone, melengestrol acetate, megestrol acetate, medroxyprogesterone acetate) από διάφορες ομάδες καταλοίπων (Stilbenes, Steroids, Corticosteroids, Resorcyclic acid lactones, Gestagens) σε μυϊκό ιστό με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS). H προκατεργασία περιλάμβανε υδρόλυση, εκχύλιση με TBME, απομάκρυνση λίπους και τελικό καθαρισμό με εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) με μικροστήλες Oasis και Αmino. Τα στεροειδή αναβολικά αναλύθηκαν, για πρώτη φορά, με χημικό ιοντισμό (APCI) σε τύπο MRM, παρακολουθώντας 2 θυγατρικά ιόντα για την αναμφίβολη επιβεβαίωσή τους. Η μέθοδος επικυρώθηκε στο όριο 0,5 ng/g με βάση την Κοινοτική Απόφαση 2002/657/EC. Η ακρίβεια και η πιστότητα της μεθόδου ήταν ικανοποιητικές. Υπολογίστηκαν οι παράμετροι CCα και CCβ, οι οποίες κυμάνθηκαν από 0,03 ng/g έως 0,14 ng/g και από 0,05 ng/g έως 0,24 ng/g, αντίστοιχα. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθηκαν ήταν αρκετά καλές και κυμάνθηκαν μεταξύ 78,7% και 119,4% με το CV (%) να κυμαίνεται μεταξύ 1,9% και 14,1%. Η μέθοδος αποδεικνύεται ευαίσθητη και αξιόπιστη και είναι κατάλληλη για εφαρμογή σε προγράμματα ελέγχου καταλοίπων. Επίσης, αναπτύχθηκε μέθοδος προσδιορισμού προγεσταγόνων (medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate, melengestrol acetate) σε λίπος με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS). Ο προσδιορισμός έγινε με θετικό ιοντισμό APCI. H προκατεργασία περιλάμβανε αυτόματο καθαρισμό, για πρώτη φορά, με GPC (gel permeation chromatography) για το διαχωρισμό των προγεσταγόνων από το λίπος. Η μέθοδος επικυρώθηκε στο όριο 1 ng/g με βάση την Κοινοτική Απόφαση 2002/657/EC. H ακρίβεια και η πιστότητα της μεθόδου ήταν ικανοποιητικές. Το CCα κυμάνθηκε μεταξύ 0,20 ng/g και 0,22 ng/g και το CCβ από 0,33 ng/g έως 0,38 ng/g. Οι ανακτήσεις που επιτεύχθηκαν ήταν ικανοποιητικές και κυμάνθηκαν μεταξύ 72% και 89,2% με το CV (%) να κυμαίνεται μεταξύ 2,5% και 16,2%. Η μέθοδος κρίνεται ειδική, απλή, ευαίσθητη, πλήρως αυτοματοποιημένη και κατάλληλη για εργαστήρια που ασχολούνται με επίσημους ελέγχους των ενώσεων αυτών. Η μέθοδος προσδιορισμού προγεσταγόνων σε λίπος ελέγχθηκε, ως προς την απόδοσή της, με συμμετοχή σε Διεργαστηριακή Δοκιμή (Δ.Δ.) που διοργάνωσε το Κοινοτικό Εργαστήριο Αναφοράς (Εθνικό Ινστιτούτο Δημόσιας Υγείας και Περιβάλλοντος, RIVM, Bilthoven, Ολλανδία). Αντικείμενο της Δ.Δ. ήταν η ανίχνευση, ο ποσοτικός προσδιορισμός και η επιβεβαίωση της οξικής μεδρόξυπρογεστερόνης (MPA) σε περινεφρικό λίπος χοίρου. Τα αποτελέσματα προσδιορισμού της οξικής μεδρόξυπρογεστερόνης κρίθηκαν ικανοποιητικά, τόσο σε χαμηλές συγκεντρώσεις της (1,03 ng/g, z-score= 0,11, CV =2%), όσο και σε υψηλές συγκεντρώσεις της (4,95 ng/g, z-score= 0,91, CV =2%). Η συνολική βαθμολογία απόδοσης των εργαστηρίων κυμάνθηκε από 6 έως 9, με το Κτηνιατρικό Εργαστήριο Σερρών να παίρνει το βαθμό 9. Αναπτύχθηκε επίσης μέθοδος ταυτόχρονου προσδιορισμού 15 στεροειδών αναβολικών (diethylstilbestrol, dienestrol, hexestrol, β-estradiol, ethynylestradiol, α/β-boldenone, α-nortestosterone, α/β-zearalenol, α/β-zaeralanol, zearalenone, stanozolol και 16β-OH-stanozolol), οι οποίες έχουν ευρύ ενδιαφέρον σε προγράμματα ελέγχου προϊόντων ζωικής προέλευσης, σε oύρα βοοειδών με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS)...