Περίληψη
Η παρούσα διατριβή πραγματεύεται την ανάπτυξη τεσσάρων νέων μεθόδων προκατεργασίας δείγματος με χρήση σύγχρονων τεχνικών και καινοτόμων υλικών σε συνδυασμό με νέες μεθόδους υγρής χρωματογραφίας και ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων (HPLC-DAD) για τον προσδιορισμό εστέρων του π-υδροξυβενζοϊκού οξέος (parabens), δισφαινολών και διαιθυλοστιλβεστρόλης, σε βιολογικά υποστρώματα και πιο συγκεκριμένα σε ιστούς μαστού, σε ούρα και σε μητρικό γάλα. Οι ενώσεις αυτές είναι ενδοκρινικοί διαταράκτες και συνδέονται με πολλές ασθένειες και μορφές καρκίνου, όπως ο καρκίνος του μαστού. Εντοπίζονται σε πλήθος βιομηχανικών προϊόντων, με αποτέλεσμα η πρόσληψη τους να συμβαίνει καθημερινά από πολλές πηγές. Επομένως, ο προσδιορισμός τους σε βιολογικά υποστρώματα παρουσιάζει ενδιαφέρον για επιδημιολογικούς και τοξικολογικούς σκοπούς. Αρχικά, η εκχύλιση με υφασμάτινο μέσο (FPSE) εφαρμόστηκε για πρώτη φορά για την εκχύλιση επτά parabens (MPB, EPB, iPPB, PPB, iBPB, BPB, BzPB) από ιστούς μαστού πριν τον προσδιορισμ ...
Η παρούσα διατριβή πραγματεύεται την ανάπτυξη τεσσάρων νέων μεθόδων προκατεργασίας δείγματος με χρήση σύγχρονων τεχνικών και καινοτόμων υλικών σε συνδυασμό με νέες μεθόδους υγρής χρωματογραφίας και ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων (HPLC-DAD) για τον προσδιορισμό εστέρων του π-υδροξυβενζοϊκού οξέος (parabens), δισφαινολών και διαιθυλοστιλβεστρόλης, σε βιολογικά υποστρώματα και πιο συγκεκριμένα σε ιστούς μαστού, σε ούρα και σε μητρικό γάλα. Οι ενώσεις αυτές είναι ενδοκρινικοί διαταράκτες και συνδέονται με πολλές ασθένειες και μορφές καρκίνου, όπως ο καρκίνος του μαστού. Εντοπίζονται σε πλήθος βιομηχανικών προϊόντων, με αποτέλεσμα η πρόσληψη τους να συμβαίνει καθημερινά από πολλές πηγές. Επομένως, ο προσδιορισμός τους σε βιολογικά υποστρώματα παρουσιάζει ενδιαφέρον για επιδημιολογικούς και τοξικολογικούς σκοπούς. Αρχικά, η εκχύλιση με υφασμάτινο μέσο (FPSE) εφαρμόστηκε για πρώτη φορά για την εκχύλιση επτά parabens (MPB, EPB, iPPB, PPB, iBPB, BPB, BzPB) από ιστούς μαστού πριν τον προσδιορισμό τους με μία νέα μέθοδο HPLC-DAD. Ο διαχωρισμός των επτά ενώσεων πραγματοποιήθηκε με την αναλυτική στήλη Spherisorb C18 (5 μm, 4,6 × 150 mm) με ισοκρατική έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 50 mM και ακετονιτρίλιο. Η ταχύτητα ροής ήταν 1,4 mL/min και ο χρόνος ανάλυσης ήταν 13,6 min. Πριν την εφαρμογή της μεθόδου FPSE, αναπτύχθηκε μία αποτελεσματική διαδικασία τεμαχισμού και ομογενοποίησης του δείγματος για την παραλαβή των στερεών υπολειμμάτων του ιστού με SLE. Η μέθοδος FPSE βελτιστοποιήθηκε ως προς τις κρίσιμες παραμέτρους. Πιο αποδοτική μεμβράνη ήταν η sol-gel PTHF (πολυ-τραϋδροφουράνιο) σε υφασμάτινο υπόστρωμα κυτταρίνης. Η μέθοδος επικυρώθηκε εφαρμόζοντας μια προσέγγιση που έλαβε υπόψη διεθνείς οδηγίες και συμπεράσματα προηγούμενων ερευνών. Επιπροσθέτως, αξιολογήθηκε ο «πράσινος» χαρακτήρας της με χρήση κατάλληλου λογισμικού. Μέσω της εφαρμογής της FPSE, επιτεύχθηκε η εναρμόνιση της μεθόδου με τις αρχές τις Πράσινης Αναλυτικής Χημείας (GAC). Τέλος, η μέθοδος εφαρμόστηκε στην ανάλυση δειγμάτων καρκινικών και μη καρκινικών ιστών. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν βιοσυσσώρευση των parabens στους ιστούς του μαστού, με τα επίπεδα συγκέντρωσης να είναι υψηλότερα στα καρκινικά δείγματα. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μία νέα μέθοδος FPSE-HPLC-DAD για την εκχύλιση και τον προσδιορισμό έξι δισφαινολών (δισφαινόλες Α, Β, C, E, F, S) και της διαιθυλοστιλβεστρόλης σε ούρα. H FPSE εφαρμόστηκε για πρώτη φορά για την εκχύλιση δισφαινολών από ούρα. Ο διαχωρισμός των επτά ενώσεων πραγματοποιήθηκε με αναλυτική στήλη Spherisorb C18 (5 μm, 4,6 × 150 mm) με βαθμωτή έκλουση. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 50 mM και ακετονιτρίλιο. Η ταχύτητα ροής ήταν 1 mL/min και ο χρόνος ανάλυσης ήταν 17,4 min. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε μία νέα μέθοδος FPSE. Η μεμβράνη sol-gel PEG (πολυ-αιθυλενογλυκόλη) σε υφασμάτινο υπόστρωμα κυτταρίνης έδωσε την πιο αποτελεσματική εκχύλιση. Η μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα, την ευαισθησία, την επιλεκτικότητα, την ακρίβεια, την πιστότητα, τη σταθερότητα και την ανθεκτικότητα. Επιπλέον, ελέγχθηκε η δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης του μέσου εκχύλισης. Οι καμπύλες βαθμονόμησης ήταν γραμμικές. Οι τιμές LOD και LOQ ήταν 0,60-0,87 ng/mL και 1,8-2,6 ng/mL, αντίστοιχα. Η μέθοδος εμφάνισε ικανοποιητική ακρίβεια, επαναληψιμότητα και ενδιάμεση πιστότητα, καθώς οι τιμές RSD ήταν χαμηλότερες από 10%. Επιπλέον, αξιολογήθηκε ως ικανοποιητικά «πράσινη» και εφαρμόστηκε στην ανάλυση δειγμάτων ούρων. Η BPA ήταν η πιο συχνά μετρούμενη ένωση, γεγονός που αντικατοπτρίζει την ευρεία βιομηχανική χρήση της. Έπειτα, παρουσιάστηκε για πρώτη φορά η εκχύλιση με υφασμάτινο μέσο ενσωματωμένου μηχανισμού ανάδευσης (MI-FPSE) και εφαρμόστηκε για την ανάπτυξη μίας νέας μεθόδου για τον προσδιορισμό πολύ κοινών διαταρακτών (MPB, EPB, PPB, BPB, BzPB) σε ούρα με HPLC-DAD. Ο διαχωρισμός έγινε σε στήλη Spherisorb C18 (5 μm, 150×4,6 mm) και πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης εντός 14 min. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 50 mM και ακετονιτρίλιο. To μέσο sol-gel CW 20 M (Carbowax 20 M) ήταν το πιο αποτελεσματικό. Το πρωτόκολλο MI-FPSE βελτιστοποιήθηκε και η μέθοδος επικυρώθηκε. Οι τιμές των LOD και LOQ ήταν 1,17-2,0 και 3,5-6,0 ng/mL, ενώ οι τιμές RSD βρέθηκαν χαμηλότερες από 9,0% σε όλες τις περιπτώσεις. Επίσης, η μέθοδος κρίθηκε ικανοποιητικά «πράσινη». Εφαρμόστηκε αποτελεσματικά στην ανάλυση δειγμάτων ούρων. Όλα τα εξεταζόμενα EDCs μετρήθηκαν σε υψηλά ποσοστά ανίχνευσης. Τέλος, η CPME εφαρμόστηκε για πρώτη φορά για την εκλεκτική εκχύλιση έξι δισφαινολών (BPA, BPB, BPC, BPE, BPF, BPS) από μητρικό γάλα και τον προσδιορισμό τους με μία νέα μέθοδο HPLC-DAD. Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη Pathfinder C18 (3,5 μm, 150×4,6 mm) με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης εντός 11,8 min. Η κινητή φάση αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 50 mM και ακετονιτρίλιο. Αναφορικά με τη μέθοδο προκατεργασίας, αρχικά αναπτύχθηκε μία μέθοδος απομάκρυνσης των λιπιδίων και των πρωτεϊνικών δομών από το δείγμα, η οποία περιλάμβανε εφαρμογή παρατεταμένης φυγοκέντρησης και προσθήκη ακετονιτριλίου. Έπειτα, βελτιστοποιήθηκαν οι κρίσιμοι παράγοντες της απόδοσης της CPME. Η κάψουλα sol-gel PEG ήταν η πιο αποδοτική. Η μέθοδος επικυρώθηκε. Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης ήταν 8,33 ng/mL και 25 ng/mL, αντίστοιχα. Οι τιμές RSD ήταν μικρότερες από 11%. Οι κάψουλες μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν έως και 6 φορές, ενώ η μέθοδος αξιολογήθηκε ως επαρκώς «πράσινη». Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή παρουσιάζονται τέσσερις νέες HPLC-DAD μέθοδοι για τον προσδιορισμό πολύ κοινών ενδοκρινικών διαταρακτών σε τρία βιολογικά υποστρώματα. Στις μεθόδους αυτές, εφαρμόζονται σύγχρονες τεχνικές μικροεκχύλισης, όπως είναι FPSE, CPME και MI-FPSE. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η MI-FPSE, η οποία αποτελεί μια ενδιαφέρουσα εξέλιξη της FPSE λαμβάνοντας υπόψη τους κινητικούς παράγοντες που επιδρούν στην εκχύλιση ισορροπίας, παρουσιάστηκε για πρώτη φορά. Όλες οι μέθοδοι αποδείχθηκαν αποτελεσματικές, σύμφωνες με τις αρχές της GAC, ικανοποιητικά ευαίσθητες, ακριβείς, επαναλήψιμες, ανθεκτικές, πρακτικές και οικονομικές.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
The present PhD thesis focuses on the development of new sample pretreatment methods using novel techniques and advanced materials in combination with new HPLC-DAD methods for the determination of esters of p-hydroxybenzoic acid (parabens), bisphenols and diethylstilbestrol, in biological matrices and more specifically in breast tissue, urine and breast milk. These compounds are endocrine disrupting chemicals (EDCs) and are related to many diseases and cancers, such as breast cancer. They are found in a plethora of industrial products. Consequently, human intake occurs daily from many sources. Therefore, the determination of these compounds in biological samples is of great interest for epidemiological and toxicological purposes. In these samples, sample pretreatment protocol is the cornerstone of the entire process. Initially, fabric phase sorptive extraction (FPSE) was applied for the first time for the extraction and subsequent chromatographic determination of seven parabens (MPB, E ...
The present PhD thesis focuses on the development of new sample pretreatment methods using novel techniques and advanced materials in combination with new HPLC-DAD methods for the determination of esters of p-hydroxybenzoic acid (parabens), bisphenols and diethylstilbestrol, in biological matrices and more specifically in breast tissue, urine and breast milk. These compounds are endocrine disrupting chemicals (EDCs) and are related to many diseases and cancers, such as breast cancer. They are found in a plethora of industrial products. Consequently, human intake occurs daily from many sources. Therefore, the determination of these compounds in biological samples is of great interest for epidemiological and toxicological purposes. In these samples, sample pretreatment protocol is the cornerstone of the entire process. Initially, fabric phase sorptive extraction (FPSE) was applied for the first time for the extraction and subsequent chromatographic determination of seven parabens (MPB, EPB, iPPB, PPB, iBPB, BPB, BzPB) in breast tissue. Prior to the FPSE workflow, a well-designed homogenization procedure was implemented. FPSE protocol was thoroughly optimized. The highest extraction efficiency was achieved by employing sol-gel poly(tetrahydrofuran) coating on cotton cellulose fabric. In addition, a new HPLC-DAD method was developed. The chromatographic separation was accomplished with a Spherisorb C18 column and an isocratic elution mode within 13,6 min. The mobile phase consisted of 50 mM ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile at a flow rate of 1.4 mL/min. The analytical performance was proved by its successful application in the analysis of cancerous and non-cancerous tissue samples originated from different sub regions of human breast including axilla, the upper left and the right quadrant. Paraben species were detected in all samples, with many of cancerous samples been positive for all seven target parabens. Moreover, concentration levels of parabens in cancerous tissues were higher than in healthy tissues. Results highlighted the bioaccumulation potential of parabens in human breast tissue, due to the constant exposure paraben containing products. Furthermore, the accordance of the developed method with GAC principles were evaluated using an appropriate tool and the new method was assessed as satisfactorily ecological.Secondly, a novel FPSE protocol was developed for rapid exposure monitoring of six bisphenol analogues, including bisphenols A, S, F, E, B, C, and diethylstilbestrol in urine prior to HPLC-DAD analysis. Sol-gel poly (ethylene glycol) coated cellulose FPSE membrane presented the best extraction performance. This polar membrane effectively possesses several advantageous features inherent to FPSE including sponge-like porous architecture of the sol-gel sorbent coating, favorable surface chemistry and flexibility. Moreover pH, solvent, and thermal stability as well as reusability of the FPSE membrane make it a suitable medium for bioanalysis. The chromatographic separation was achieved within 17.4 min on a Spherisorb C18 column and a gradient elution program with mobile phase consisted of 50mM ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile. The developed method was validated in terms of linearity, sensitivity, selectivity, precision, accuracy, stability, and ruggedness. The limits of detection (LODs) and quantification (LOQs) varied from 0.60-0.87 ng/mL and 1.8-2.6 ng/mL, respectively. The RSD values were lower than 10%. The method was evaluated for its agreement with the GAC principles with an appropriate software and found to be satisfactorily "green". The effectiveness of the proposed method was confirmed by its successful implementation in the analysis of real urine samples.Thirdly, magnet-integrated fabric phase sorptive extraction (MI-FPSE) device, which is an evolution of the conventional FPSE membrane, was introduced and applied for the first time for the determination of selected widely used EDCs as model analytes in human urine by HPLC-DAD. The sol-gel Carbowax 20 M coated on cellulose fabric substrate MI-FPSE device was efficiently employed for the establishment of the extraction protocol. The sample preparation workflow was methodically optimized. The chromatographic separation was performed on a Spherisorb C18 column and a gradient elution program within 14 minutes. Mobile phase consisted of 50mM ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile. The method was validated towards linearity, sensitivity, selectivity, precision, accuracy, and stability and it was also evaluated for its ecological character and was considered sufficiently "green". LODs and LOQs ranged between 1.17-2.0 and 3.5-6.0 ng/mL, while RSD values were found lower than 9.0%. The method was efficiently applied to the analysis of real samples. The chosen EDCs were measured at high detection levels. The new MI-FPSE device has demonstrated its performance superiority as a magnet integrated stand-alone extraction device and could be considered as a significant improvement in the field of analytical/bioanalytical sample preparation.Finally, capsule phase microextraction (CPME) was applied for the first time for the extraction of a mixture of bisphenols from breast milk prior to their HPLC-DAD determination. The chromatographic separation was performed on a Pathfinder C18 column and a gradient elution program within 11.8 minutes. Mobile phase consisted of 50mM ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile. Prior to CPME protocol, an efficient workflow was employed for the removal of lipids and proteins. The sol-gel poly(ethylene glycol) capsules showed the best extraction efficiency. Critical factors of the extraction performance were investigated and optimized, and the final CPME-HPLC-DAD method was fully validated. LODs and LOQ were 8.33 ng/mL and 25 ng/mL, respectively. RSD values were lower than 11%. Moreover, the method was assessed for its compliance with GAC principles and was proved to be satisfactorily "green". In conclusion, in the resent thesis four new analytical methods were developed for the determination of widespread EDCs in three biological matrices employing HPLC-DAD. In these methods, sophisticated microextraction techniques (FPSE, CPME, MI-FPSE) were applied. Interestingly, MI-FPSE, which is an interesting evolution of FPSE considering the kinetic factors affecting the equilibrium extraction, was introduced for the first time. All methods proved to be efficient, economical, conforming to GAC principles, sufficiently sensitive, accurate and reproducible. Thus, they demonstrated to be useful tools not only in routine analysis but also for purposes of extensive epidemiological and toxicological studies.
περισσότερα