Χρήση νανοσυστημάτων στην ανίχνευση μελών του γένους Leishmania

Abstract

Leishmaniosis is a parasitic zoonotic disease that represents a significant publichealth threat. The accurate diagnosis of the disease is of determinative importance inthe application of targeted treatment and minimizes the danger of transmissioncontributing to the decrease of the number of cases and the limitation of theirgeographic distribution. The use of bio-nanoparticles could contribute significantly tothe detection of the pathogen in clinical samples without the need of dedicatedequipment.The aim of this study was the design of an easily applicable, fast, specific andreliable technique for the detection of Leishmania spp. using cadmium selenide(CdSe) quantum dots and gold nanoparticles.Initially, a comparative evaluation of four PCR methods was performed for thedetection of Leishmania spp. in order to define the optimum target-DNA region of theLeishmania genome, and conclude to a reference methodology. Four (4)oligonucleotide-probes were designed to be conjugated with commercially availablegold nanoparticles for the detection of Leishmania DNA. For the same reason(detection of Leishmania DNA) two oligonucleotide-probes were designed, the one tobe conjugated with quantum dots and the other with magnetic beads. For the detectionof surface antigen of Leishmania, quantum dots and magnetic beads were conjugatedwith two antibodies specific for parasite’s surface antigens. The evaluation of themethods under study was performed in regard to their sensitivity, specificity, minimum detection limit (MDL), and specifically for the PCR methods, repeatability and reproducibility. The reference material used consisted of culturedisolates and clinical samples that were collected from dogs brought to veterinaryclinics with suspicion of leismaniosis. Similar results were recorded by all PCR methods with regard mainly to culturedisolates. The percentage of positive results recorded by method C was significantlyhigher compared to the other three (58.1%). The respective measurement for methodsA, B, and D, was similar and varied in all cases between 19 and 25%. The relativesensitivity and specificity were referenced to method C that produced the highestpercentage of confirmed positive and negative results. Effectively sensitivity andspecificity of methods A, B, and D were defined to 50.7% (33/65), 43% (28/65), 40%(26/65) and 90.8% (69/76), 93.4% (71/76), 89.5% (68/76) respectively. TheMDL of the methods A-D was calculated as the mean average of the measurement ofseven repeats, at 30.7, 5, 3.7, and 5 promastigotes/ml, respectively. Repeatabilitywas excellent for the all methods, as it was higher than 0.75, something that was statistically significant at 5% level. Reproducibility was good to excellent dependingon the PCR reagents that were used. The positive and the negative controls werecorrectly identified with all three combinations of nanoparticles. The relativesensitivity and specificity of the DNA detection method with gold nanoparticlesreferenced to PCR, were 92% and100% respectively depending on the material to beexamined, while the MDL was defined at 11,5ng/ml. The MDL of the DNA detectionmethod using quantum dots was 3.125ng/ml, while the specificity of cellular detectionmethod with quantum dots was 103 cells/ml.The three methods described in the present study provide an easy, fast andeconomic way for the detection of members of genus Leishmania using nano-probes.The proposed methods can be used for the development of diagnostic methodsfor use particularly in enzootic regions where detection of very small amounts ofparasite is not of top priority.

Η λεϊσμανίωση είναι μια παρασιτική νόσος του σκύλου που αποτελεί σημαντικόπρόβλημα για τη δημόσια υγεία. Η έγκαιρη και ακριβής διάγνωση της ασθένειας είναικαθοριστικής σημασίας στην εφαρμογή στοχευμένης θεραπείας και μειώνει τονκίνδυνο μετάδοσης, συμβάλλοντας στον περιορισμό του αριθμού των κρουσμάτωνκαι της γεωγραφικής εξάπλωσης. Η χρήση βιονανοσυστημάτων θα μπορούσε νασυνεισφέρει σημαντικά στη διευκόλυνση της ανίχνευσης του συγκεκριμένουπαθογόνου σε κλινικά δείγματα χωρίς τη χρήση εξειδικευμένων συσκευών υψηλούκόστους.Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αναπτυχθεί μια εύκολα εφαρμόσιμη,γρήγορη, ειδική και αξιόπιστη μέθοδος ανίχνευσης της Leishmania spp. χρησιμοποιώντας κβαντικά κοκκία σεληνιούχου καδμίου και νανοσωματίδια χρυσού.Αρχικά, έγινε συγκριτική αξιολόγηση τεσσάρων μεθόδων PCR για ανίχνευση τηςLeishmania spp. προκειμένου να επιλεχθεί η κατάλληλη περιοχή-στόχος τουγενώματος της Leishmania που θα στόχευαν οι ολιγονουκλεοτιδικοί-ανιχνευτές καινα αναδειχθεί μια επαρκής μέθοδος αναφοράς. Σχεδιάστηκαν στη συνέχεια 4ολιγονουκλεοτιδικοί-ανιχνευτές που συνδέθηκαν με εμπορικά διαθέσιμανανοσωματίδια χρυσού για την ανίχνευση του DNA της Leishmania. Για τον ίδιοσκοπό (ανίχνευση DNA της Leishmania) σχεδιάστηκαν δύο ολιγονουκλεοτιδικοί- ανιχνευτές, ένας για σύνδεση με κβαντικά κοκκία και ο άλλος για σύνδεση μεμαγνητικά σφαιρίδια. Για την ανίχνευση ενός επιφανειακού αντιγόνου τηςLeishmania, τα κβαντικά κοκκία και τα μαγνητικά σφαιρίδια συνδέθηκαν με δύοειδικά για το παράσιτο αντισώματα. Η αξιολόγηση των υπό μελέτη μεθόδων έγινεαναφορικά με την ευαισθησία τους, την ειδικότητά τους, το ελάχιστο όριο ανίχνευσήςτους (Ε.Ο.Α.), και ειδικά για τις μεθόδους PCR, την επαναληψιμότητα και τηναναπαραγωγιμότητά τους. Το υλικό αναφοράς που χρησιμοποιήθηκε συνίστατο απόστελέχη απομονωμένα σε καλλιέργεια και κλινικά δείγματα που συλλέχθηκαν απόσκύλους που είχαν προσκομιστεί σε κτηνιατρικές κλινικές με υποψία λεϊσμανίωσης.Με όλες τις μεθόδους PCR που εξετάστηκαν καταγράφηκαν παρόμοιααποτελέσματα κυρίως αναφορικά με τα καλλιεργημένα στελέχη. Το υψηλότεροποσοστό θετικών δειγμάτων ανιχνεύτηκε με τη μέθοδο Γ (58.1%). Με τις άλλες τρειςμεθόδους PCR, το ποσοστό θετικότητας ήταν σημαντικά χαμηλότερο και κυμάνθηκεσε όλες τις περιπτώσεις μεταξύ 19 και 25%. Η σχετική ευαισθησία και ειδικότηταεκτιμήθηκε αναφορικά με τη μέθοδο Γ, με την οποία ανιχνεύτηκε το υψηλότεροποσοστό επιβεβαιωμένων θετικών και αρνητικών αποτελεσμάτων. Έτσι για τιςμεθόδους Α, Β, και Δ, η ευαισθησία και ειδικότητα διαμορφώθηκε αντίστοιχα στο 50.7% (33/65), 43% (28/65), 40% (26/65) και 90.8% (69/76), 93.4% (71/76) 89.5%(68/76). Το μέσο ελάχιστο όριο ανίχνευσης των μεθόδων Α-Δ σε επτά επαναλήψειςυπολογίστηκε αντίστοιχα στα 30.7, 5, 3.7, και 5 προμαστιγωτά/ml. Ηεπαναληψιμότητα ήταν εξαιρετική για όλες τις μεθόδους αφού ήταν υψηλότερη από0.75, κάτι που ήταν στατιστικά σημαντικό σε επίπεδο 5%, ενώ η αναπαραγωγιμότηταήταν καλή έως εξαιρετική ανάλογα με τα αντιδραστήρια PCR πουχρησιμοποιήθηκαν. Οι θετικοί και οι αρνητικοί μάρτυρες ανιχνεύτηκαν σωστά και μετους τρεις συνδυασμούς νανοσωματιδίων. Η σχετική ευαισθησία και ειδικότητα τηςμεθόδου ανίχνευσης DNA με τα νανοσωματίδια χρυσού συγκριτικά με τη μέθοδοςαναφοράς, προσδιορίστηκε σε 92% και 100% αντίστοιχα αναλόγως του εξεταζόμενουυλικού, ενώ το Ε.Ο.Α., σε 11,5 ng/μl. Οι αντίστοιχες τιμές που καταγράφηκαν στοπλαίσιο του προσδιορισμού της ειδικότητας και της ευαισθησίας της μεθόδουανίχνευσης DNA με χρήση κβαντικών κοκκίων ήταν 3,125 ng/μl, ενώ η ειδικότητατης μεθόδου ανίχνευσης των κυττάρων του πρωτοζώου με κβαντικά κοκκία ήταν 103κύτταρα/ml. Οι τρεις μέθοδοι που περιγράφηκαν στην παρούσα μελέτη παρέχουν ένανεύκολο, γρήγορο και οικονομικό τρόπο για την ανίχνευση μελών του γένουςLeishmania με τη χρήση των συγκεκριμένου τύπου νανο-ανιχνευτών. Οιπροτεινόμενες μέθοδοι μπορεί να αποτελέσουν βάση για την ανάπτυξη διαγνωστικώνμεθόδων ελέγχου για χρήση σε ενζωοτικές περιοχές ιδίως εάν λόγω διαθέσιμωνπόρων δεν αποτελεί προτεραιότητα η ανίχνευση πολύ μικρής ποσότητας τουπαρασίτου.