Μελέτη της ρύθμισης του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα HIF-1a μέσω φωσφορυλίωσης και του ρόλου του στον κυτταρικό μεταβολισμό

Abstract

Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is a heterodimeric transcription factor that regulates the adaptation of cells to reduced oxygen level conditions. HIF-1 is composed of an alpha subunit (HIF-1α) that is induced by hypoxia and a beta subunit (HIF-1β or ARNT), which is constitutively expressed. HIF-1α stabiliyty depends on oxygen levels but HIF-1 activity is also regulated by oxygen-independent mechanisms, involving post-translational modifications such as phosphorylation.ERK phosphorylates the ETD domain of HIF-1α and stimulates its activity by blocking its nuclear export. The first part of this study concerns the investigation of the hypothesis that expression of ETD or its mutant forms as recombinant independent polypeptides in cells that were cultured under hypoxic conditions may inhibit the phosphorylation and subsequent activation of endogenous HIF-1α. Experiments with different plasmid expression vectors and in different cell lines have shown that ETD peptides containing the ERK phosphorylation sites (ETD wt, ETD I→A) or a mutation mimicking this phosphorylation (ETD S→E) were localized predominantly inside the nucleus, triggered HIF-1 export to the cytoplasm and reduced HIF-1 transcriptional activity. In contrast, a mutant ETD peptide that cannot be modified by ERK (ETD S→A) was cytoplasmic and did not affect significantly the activity of HIF-1α. According to these results ETD can be indeed used as the basis for designing effective and specific peptide inhibitors of HIF-1.The second part of this study concerns the investigation of the effect of CK1δ, that modifies the PAS domain of HIF-1α and inhibits its activity on HIF-1α/ARNT complex formation in intact or living cells using the microscopical methods in situ Proximity Ligation Assay (in situ PLA) or the Fluorescence Recovery After Photobleaching assay (FRAP), respectively. The results have shown that phosphorylation by CK1δ inhibits the heterodimerization of HIF-1α with ARNT and its binding to chromatin. Furthermore, chromatin immunoprecipitation experiments have shown that inhibition of CK1δ stimulates the interaction of HIF-1α with the promoter of the gene for lipin-1, an enzyme involved in synthesis of triglycerides. At the same time, inhibition of CK1δ promoted the formation of lipid droplets and the proliferation of both cancer and primary human cells under hypoxic conditions in a HIF-1α and lipin-1 dependent manner. These results provide evidence for the involvement of CK1δ in the metabolic adaptation of cells to hypoxic conditions and reveal new ways of regulating cellular proliferation under hypoxia.Overall, this study offers a better understanding of HIF-1 regulation by ERK and CK1δ and could lead to the development of novel therapeutic approaches for pathological conditions such as cancer, where suppression of HIF-1 activity is necessary or ischemic diseases, where instend promoting of HIF-1 function is desirable.

Ο επαγόμενος από την υποξία παράγοντας HIF-1 είναι ένας ετεροδιμερής μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την προσαρμογή των κυττάρων σε συνθήκες μειωμένης συγκέντρωσης οξυγόνου. Ο HIF-1 αποτελείται από μια αλφα υπομονάδα (HIF-1α), που επάγεται από την υποξία, και μια βήτα υπομονάδα (HIF-1β ή ARNT) η οποία εκφράζεται συνεχώς. Η σταθερότητα του HIF-1α εξαρτάται από τη συγκέντρωση οξυγόνου αλλά η δράση του HIF-1 ρυθμίζεται και από ανεξάρτητους του οξυγόνου μηχανισμούς που δρουν μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, όπως είναι η φωσφορυλίωση. Η κινάση ERK φωσφορυλιώνει τον HIF-1α στην επικράτεια ETD και διεγείρει τη δράση του, αναστέλλοντας την έξοδό του από τον πυρήνα. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής εξατάσθηκε η υπόθεση ότι η έκφραση της επικράτειας ETD ή μεταλλαγμένων μορφών της ως ανασυνδυασμένα ανεξάρτητα πολυπεπτίδια, σε κύτταρα που καλλιεργούνται σε συνθήκες υποξίας είναι δυνατόν να εμποδίσει την φωσφορυλίωση και συνεπώς την ενεργοποίηση του ενδογενούς HIF-1α. Πειράματα με διαφορετικούς πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης και σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι τα πολυπεπτίδια ETD τα οποία περιέχουν τις θέσεις φωσφορυλίωσης της κινάσης ERK (ETD wt, ETD I→A) ή μετάλλαξη που μιμείται την φωσφορυλίωση (ETD S→E) εντοπίστηκαν κυρίως στον πυρήνα, προκάλεσαν την εξαγωγή του HIF-1α στο κυτταρόπλασμα και μείωσαν σημαντικά την μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1 στην υποξία. Αντίθετα, το μεταλλαγμένο πολυπεπτίδιο που δεν μπορεί να φωσφορυλιωθεί από την ERK (ETD S→A) εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και δεν επηρέασε σημαντικά τον εντοπισμό και τη δραστικότητα του HIF-1α. Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, η επικράτεια ETD μπορεί πράγματι να χρησιμοποιηθεί ως βάση σχεδίασης ειδικών και αποτελεσματικών πεπτιδικών αναστολέων του HIF-1.Στο δεύτερο μέρος μελετήθηκε η επίδραση της κινάσης CK1δ, που φωσφορυλιώνει την επικράτεια PAS του HIF-1α και αναστέλλει τη δράση του, στον σχηματισμό συμπλόκων HIF-1α/ ARNT σε ακέραια ή ζωντανά κύτταρα, χρησιμοποιώντας τις μικροσκοπικές μεθόδους σύνδεση εγγύτητας in situ (in situ PLA) και επαναφορά φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (FRAP), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση από τη CK1δ εμποδίζει τον ετεροδιμερισμό του HIF-1α με τον ARNT και την δέσμευσή του στη χρωματίνη. Επιπλέον, με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης δείχθηκε ότι η αναστολή της CK1δ ενισχύει την αλληλεπίδραση του HIF-1α με τον υποκινητή του γονιδίου της λιπίνης-1, ενζύμου που συμμετέχει στη σύνθεση τριγλυκεριδίων στην υποξία. Ταυτόχρονα η αναστολή της CK1δ ενίσχυσε τον σχηματισμό λιποσταγονιδίων και τον πολλαπλασιασμό τόσο καρκινικών όσο και πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων σε συνθήκες υποξίας, με εξαρτώμενο από τον HIF-1α και τη λιπίνη-1 τρόπο. Τα αποτελέσματα αυτά αποκαλύπτουν την εμπλοκή της CK1δ στη μεταβολική προσαρμογή των κυττάρων σε συνθήκες υποξίας και αναδεικνύουν νέους τρόπους ρύθμισης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων κατά την υποξία.Συνολικά, τα παραπάνω ευρήματα διελευκάνουν περαιτέρω τη ρύθμιση της δράσης του HIF-1 μέσω φωσφορυλίωσης από τις κινάσες ERK1/2 και CK1δ και επιτρέπουν την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος, όπου είναι απαραίτητη η καταστολή της δράσης του HIF-1α, ή οι ισχαιμικές παθήσεις, όπου, αντίθετα, είναι επιθυμητή η ενίσχυση της λειτουργίας του HIF-1.