Αναδιαμόρφωση των λείων μυϊκών ινών των αεραγωγών από παράγοντες φλεγμονής: ο ρόλος του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα (HIF)-1

Abstract

Αirway smooth muscle cells (SMC) participate in remodeling observed in airway inflammatory diseases as structural and as immunomodulatory cells. Airway inflammation is accompanied by the development of local hypoxia. The major mediator of the cellular response to hypoxia is the Hypoxia Inducible Factor, HIF-1. Its regulatory subunit HIF-1α is stabilized during hypoxia , translocates to the nucleus, dimerizes with the HIF-1β subunit and induces the transcription of genes that regulate the survival of cells. In addition, HIF-1α is induced by cytokines and growth factors under normoxic conditions in various cell types. In this study we investigated the effect of the proinflammatory cytokine TNFα on the induction of HIF-1α, its target genes and inflammatory mediators in primary cultures of differentiated human bronchial SMC and rabbit trachea SMC at normoxic and hypoxic conditions. TNFα increases the levels of HIF-1α mRNA and protein at normoxia and hypoxia. This induction by TNFα is mediated by the NF-κB intracellular signaling pathway and is abolished by the NF-κB inhibitor RO 106-9920. Similar results were revealed by using the ROS inhibitor, DPI. Furthermore, the use of the transcription inhibitor Actinomycin D showed that induction of HIF-1α was a result of increased HIF-1α gene transcription. However, the observed induction of HIF-1α, both at the protein and at the mRNA level, was not followed by a corresponding increase in its transcriptional activity as the transcription of HIF target genes remained low in the presence of TNFα during normoxia and was even decreased at hypoxia. This decrease is likely due to inhibition of dimerization between HIF-1α and ARNT and binding to HREs. In addition, there were significant differences in the effect of TNFα and hypoxia at the expression of inflammatory mediators from airway SMC. Specifically, TNFα increased significantly the mRNA levels of the inflammatory factors IL-6 and RANTES and the adhesion molecules ICAM and VCAM. Under hypoxia, while the induction of IL-6 was increased further, the induction of RANTES and ICAM remained unchanged while the induction of VCAM was decreased by TNFα. In conclusion, it has been shown that TNFα induces HIF-1α by increasing the transcription of HIF-1α via an NF-κB dependent pathway. However, at the same time TNFα inhibits the dimerisation of HIF-1α with ARNT, binding to HRES and HIF-1 transcriptional activity. It appears that TNFα and hypoxia have opposing effects on gene expression in SMC, indicating a protective probably independent of HREs role of HIF-1 to the airway SMC in response to inflammation.

Τα λεία μυϊκά κύτταρα (ΛΜΚ) των αεραγωγών συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση των αεραγωγών που παρατηρούνται στις φλεγμονώδεις νόσους του αναπνευστικού ως δομικά και ως ανοσορυθμιστικά κύτταρα. Η φλεγμονή των αεραγωγών συνοδεύεται από την ανάπτυξη τοπικής υποξίας. Ο κύριος ρυθμιστής της υποξίας έχει δειχθεί ότι είναι ο επαγόμενος από την υποξία παράγοντας HIF-1. Στην υποξία, η ρυθμιστική υπομονάδα του, HIF-1α σταθεροποιείται, μετατοπίζεται στον πυρήνα και ο HIF-1 επάγει την μεταγραφή γονιδίων που εξασφαλίζουν την επιβίωση των κυττάρων. Επιπλέον, ο HIF-1α επάγεται από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες και σε συνθήκες νορμοξίας σε διάφορους τύπους κυττάρων. Στη παρούσα μελέτη ερευνήθηκε η επίδραση της προφλεγμονώδους κυτοκίνης TNFα στην επαγωγή του HIF-1α, στη μεταγραφή των γονιδίων στόχων του HIF-1 και στη μεταγραφή γονιδίων μεσολαβητών της φλεγμονώδους απόκρισης σε πρωτογενείς καλλιέργειες διαφοροποιημένων ανθρώπινων ΛΜΚ βρόγχων και καλλιέργειες ΛΜΚ τραχείας κουνελιού σε συνθήκες νορμοξίας και υποξίας. Ο TNFα αυξάνει τα επίπεδα της πρωτεΐνης και του mRNA του HIF-1α, τόσο στην νορμοξία όσο και στην υποξία. Η επαγωγή αυτή μεσολαβείται από το ενδοκυττάριο σηματοδοτικό μονοπάτι του NF-κB καθώς παρατηρήθηκε μια ανάλογη αύξηση των επιπέδων της φωσφορυλίωσης και του πυρηνικού πολλαπλασιασμού της υπομονάδας p65 του NF-κB με τα επίπεδα mRNA του HIF-1α σε συνθήκες νορμοξίας. Ταυτόχρονα, η χρήση του αναστολέα RO 106-9920 του NF-κB συνοδεύτηκε από μείωση των επιπέδων του mRNA του HIF-1α. Παράλληλα, με χρήση του αναστολέα της μεταγραφής ακτινομυκίνη D δείχθηκε ότι η επαγωγή του HIF-1α προκύπτει μέσω αύξησης της μεταγραφής του γονιδίου του. Ωστόσο, η παρατηρούμενη επαγωγή του HIF-1α τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης, όσο και σε επίπεδο mRNA δεν συνοδεύτηκε από αντίστοιχη αύξηση της μεταγραφικής ενεργότητας του HIF-1, καθώς η μεταγραφή των γονιδίων στόχων του, παρέμεινε χαμηλή παρουσία του TNFα στη νορμοξία και ταυτόχρονα μειώθηκε στην υποξία. Η μείωση αυτή πιθανόν οφείλεται στην αναστολή της αλληλεπίδρασης του HIF-1α με τον ARNT με αποτέλεσμα την αδυναμία δέσμευσης τους στα HREs. Επίσης, σημειώθηκαν σημαντικές διαφορές στις επιδράσεις του TNFα και της υποξίας στην έκφραση φλεγμονωδών παραγόντων από τα ΛΜΚ των αεραγωγών. Συγκεκριμένα, παρουσία TNFα αυξήθηκαν σημαντικά τα επιπέδα mRNA των φλεγμονωδών παραγόντων IL-6 και RANTES καθώς και των μορίων προσκόλλησης ICAM και VCAM. Σε συνθήκες υποξίας, η επαγωγή των RANTES και ICAM παρέμεινε αμετάβλητη, ενώ μειώθηκε η επαγωγή του VCAM από τον TNFα. Συνοψίζοντας, παρατηρήθηκε ότι ο TNFα επάγει τον HIF-1α μέσω αύξησης της μεταγραφής του με τη μεσολάβηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του NF-κB. Παρόλα αυτά, η επαγωγή αυτή δεν επηρεάζει την μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1 στην νορμοξία, ενώ την καταστέλλει κατά την υποξία εξαιτίας της αναστολής της σύνδεσης του HIF-1α με τον ARNT. Φαίνεται λοιπόν ότι ο TNFα και η υποξία δρουν ανταγωνιστικά στην έκφραση γονιδίων στα ΛΜΚ, υποδεικνύοντας έναν προστατευτικό πιθανώς ανεξάρτητα από τα HREs ρόλο του HIF-1α στην απόκριση των ΛΜΚ στη φλεγμονή των αεραγωγών.