Βιοχημεία της υποξίας: Ρύθμιση του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α από την κινάση της καζεΐνης CK1

Abstract

Hypoxia inducible factor 1, HIF-1, is a heterodimeric transcription factor regulating the cellular response to hypoxia and implicated in many pathological conditions including cancer, ischemia and inflammation. Its inducible subunit, HIF-1α is controlled by oxygen levels as well as by various oxygen-independent mechanisms. Post-translational modifications like hydroxylation and phosphorylation play a very important role in HIF-1α regulation. The present study analyzes the phosphorylation of HIF-1α in its N-terminal domain and its role in the activity of HIF-1. In order to identify the phosphorylation sites, small parts of HIF-1α were constructed as GST-fusion proteins and subjected to in vitro phosphorylation by Hela cell nuclear extracts. The phosphorylation site was mapped between HIF-1α amino acids 229-251. Analysis of this sequence revealed serine²⁴⁷ as a potential target of phosphorylation by CK1. In vitro phosphorylation assays showed that HIF-1α was indeed phosphorylated by recombinant CK1. Conversion of Ser²⁴⁷ of HIF-1α into Ala (S247A) as well as inhibition of CK1 by chemical inhibitors impaired this phosphorylation. Moreover, overexpression of the mutant S247A form of HIF-1α in mammalian and yeast cells, or inhibition of CK1, or silencing of CK1δ by siRNA, caused an increase in HIF-1 transcriptional activity in different cell lines. On the other hand, overexpression of the active form of CK1δ or overexpression of HIF-1α mutant form carrying the ‘phosphomimetic’ mutation S247D, inhibited the activity of HIF-1. Phosphorylation of Ser²⁴⁷ by CK1 did not affect HIF-1α protein expression levels, its stability or its subcellular localization. However, co-immunoprecipitation and in vitro binding assays showed that CK1 inhibition enhanced interaction of HIF1α with ARNT and that mutation of Ser²⁴⁷ affects the heterodimer complex formation. A structural model of the complex between the PAS-B domains of HIF-1α and ARNT showed that Ser²⁴⁷ is accessible to kinases and its phosphorylation reduces heterodimeric complex stability. To conclude, a new regulatory mechanism of HIF-1α by phosphorylation was identified. HIF-1α is phosphorylated at serine²⁴⁷ by CK1 and this modification inhibits HIF-1 activity by preventing the formation of the heterodimeric complex between HIF-1α and ARNT. This new mechanism can be a thepapeutic target in pathological conditions that involve hypoxia and HIF-1.

Ο επαγόµενος από την υποξία παράγοντας, HIF-1 είναι ένας ετεροδιµερής µεταγραφικός παράγοντας που ρυθµίζει την απόκριση στην υποξία και εµπλέκεται σε παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος, η ισχαιµία και η φλεγµονή. Η επαγόµενη υποµονάδα HIF-1α ρυθµίζεται από το οξυγόνο αλλά και από ανεξάρτητους µηχανισµούς. Σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση του HIF-1α παίζουν η υδροξυλίωση και η φωσφορυλίωση. Στην παρούσα διατριβή µελετήθηκε η φωσφορυλίωση του HIF-1α στην αµινοτελική του επικράτεια και ο ρόλος της στη δράση του HIF-1. Προκειµένου να βρεθεί η αλληλουχία φωσφορυλίωσης κατασκευάστηκαν µικρά ανασυνδυασµένα τµήµατα τoυ HIF-1α ως πρωτεΐνες σύντηξης µε GST και φωσφορυλιώθηκαν in vitro µε πυρηνικά εκχυλίσµατα κυττάρων HeLa. Η αλληλουχία φωσφορυλίωσης περιορίστηκε ανάµεσα στα αµινοξέα 229-251. Η ανάλυση της υπέδειξε την Ser²⁴⁷ ως πιθανό στόχο φωσφορυλίωσης από την κινάση της καζεΐνης 1, CK1. Από πειράµατα in vitro βρέθηκε ότι πράγµατι ο HIF-1α φωσφορυλιώνεται από τη CK1. Η µετατροπή της Ser²⁴⁷ του HIF-1α σε Ala (S247A) µέσω στοχευµένης µεταλλαξιγένεσης αλλά και χηµικοί αναστολείς της CK1 ανέστειλαν τη φωσφορυλίωση τόσο από τη CK1 όσο και τα πυρηνικά εκχυλίσµατα. Επιπλέον, η υπερέκφραση της µορφής S247A του HIF-1α σε κύτταρα θηλαστικών και ζύµης, η αναστολή της CK1 και η αποσιώπηση της CK1δ µε siRNA, αύξησαν τη µεταγραφική ενεργότητα του HIF-1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Αντίθετα, η υπερέκφραση της ενεργής µορφής της CK1δ ή της µορφής του HIF-1α που περιέχει τη «φωσφοµιµητική» µετάλλαξη Ser²⁴⁷ σε Asp (S247D) ανέστειλαν τη δράση του HIF1. Η φωσφορυλίωση της Ser²⁴⁷ του HIF-1α από τη CK1 δεν επηρέασε την έκφραση και σταθερότητά του ούτε τον υποκυτταρικό του εντοπισµό. Ωστόσο, έπειτα από πειράµατα ανοσοκατακρήµνισης και in vitro δέσµευσης, παρατηρήθηκε ότι η αναστολή της CK1 ενίσχυσε την αλληλεπίδραση του HIF-1α µε τον ARNT και ότι η τροποποίηση της Ser²⁴⁷ επηρεάζει το σχηµατισµό του ετεροδιµερούς. Ένα δοµικό µοντέλο του συµπλόκου των περιοχών PAS-B του HIF-1α και του ARNT έδειξε ότι η Ser²⁴⁷ είναι προσβάσιµη και ότι η φωσφορυλίωσή της επηρεάζει αρνητικά τη σταθερότητα του ετεροδιµερούς. Συµπερασµατικά, βρέθηκε ένας νέος µηχανισµός ρύθµισης του HIF-1α µέσω της φωσφορυλίωσής στη Ser²⁴⁷ από τη CK1. Η φωσφορυλίωση αυτή αναστέλλει τη δράση του HIF-1 µέσω παρεµπόδισης του σχηµατισµού ετεροδιµερούς µεταξύ του HIF-1α µε τον ARNT. Ο νέος αυτός µηχανισµός µπορεί να αποτελέσει θεραπευτικό στόχο σε παθολογικές καταστάσεις στις οποίες εµπλέκεται η υποξία και ο HIF-1.